排序服务
服务清单
先进技术基因组学核心(ATGC)提供几种测序服务，包括:
- Illumina公司下一代测序
- Sanger-based DNA测序
- Sanger-based基因测序
- 单细胞分析
在下面了解更多关于这些服务的信息。
Illumina公司下一代测序
ATGC提供了一个完整的下一代测序服务。研究人员向设施提供基因组DNA、总RNA或芯片DNA(取决于要求的应用)，设施提供完整的样品处理。
门店服务包括：
1.项目咨询和一名设施代表和MDACC生物信息学家的预算规划。
2.图书馆准备：NGS库由表示整个样本的随机片段组成。它是通过将DNA剪切到150-400个基片来创建的。将这些片段连接到特定适配器。然后选择适当尺寸的图书馆片段（尺寸为依赖性）和分离。在样品清理步骤之后，通过QPCR量化所得库并使用安静挂毯检查质量。ATGC使用EPPENDORF ENPMOTION 5075和安捷伦BRAVO液体处理程序具有自动化图书馆准备。
3.集群生成:文库片段通过杂交片段与与适配器序列互补的寡核苷酸草坪结合到流细胞上。结合的片段通过桥放大无性地扩增，从而产生数以百万计的个体密集的无性系簇。集群生成是在Illumina cBOT仪器的封闭环境中发生的。在NovaSeq6000、NextSeq500和iSeq 100仪器上，仪表上发生簇生成。
4.Illumina公司测序:流细胞测序采用Illumina完善的合成测序化学。该化学使用两个(NovaSeq6000, NextSeq500)或四个(HiSeq4000和MiSeq)可逆终止核苷酸，每个都有一个化学阻塞的羟基。开始测序时，引物与流动细胞上单链共价结合的模板杂交。然后用荧光标记的核苷酸流过流细胞。在链延伸的过程中，荧光核苷酸竞争并入生长中的DNA链。一个单一的互补核苷酸被合并到每个DNA中，终止链并同时导致数百万个DNA簇的一个碱基扩展。合并的核苷酸被激光激发，并发出它们特有的荧光(或无荧光)。这种荧光在成像步骤中被检测和记录。碱基检测后，荧光染料被裂解，3 '羟基块被化学逆转，使链继续延伸。这个过程重复36到300次，产生一系列的图像。
5.数据分析：生成的原始数据被成像，并在序列分析开始前进行基调用。生成的序列被解复用，与参考基因组对齐，并转移到机构服务器，MDACC生物仿制学家在那里访问序列数据。数据分析是与来自生物信息系的教员合作进行的。
ATGC提供免费的NGS项目咨询。
接触Erika汤普森ejthomps@mdanderson.org预约
| 流池类型及周期# | 数量的车道 | 运行选项 | 约。PF簇（M） | 估计输出(Gb) * | MDACC价格* * |
|---|---|---|---|---|---|
| s - ' - 500 | 1 | 2 * | 650-800. | 325 - 400 | $ 6,947 |
| s - ' - 500 Xp | 2 | 2 * | 325 - 400 | 162 - 200 | 3633美元 |
| s - ' - 300 |
1 | 2x150 | 650-800. | 200 - 250 | 5095美元 |
| s - ' - 300 Xp | 2 | 2x150 | 325 - 400 | 100 - 125 | 2781美元 |
| S-Prime-100 |
1 | 1 x100, 2×50,26 x91x8 | 650-800. | 65 - 80 | $ 3,180 |
| s - ' - 100 Xp | 2 | 1 x100, 2×50,26 x91x8 | 325 - 400 | 32-40 | 1751美元 |
| s1 - 300 | 1 | 2x150 | 1300 - 1600 | 400 - 500 | 7829美元 |
| s1 - 300 Xp | 2 | 2x150 | 650-800. | 200 - 250 | 4,081美元 |
| s1 - 200 | 1 | 2 x100 | 1300 - 1600 | 266 - 333 | 7164美元 |
| s1 - 200 Xp | 2 | 2 x100 | 650-800. | 133 - 166 | 3748美元 |
| s1 - 100 | 1 | 1 x100, 2×50,26 x91 或者28 x91 |
1300 - 1600 | 134 - 167 | 5590美元 |
| s1 - 100 Xp | 2 | 1 x100, 2×50,26 x91 或者28 x91 |
650-800. | 67 - 83 | 2962美元 |
| S2-300. | 1 | 2x150 | 3300 - 4100 | 1000 - 1250 | 13285美元 |
| s2 - 300 Xp | 2 | 2x150 | 1650 - 2050 | 500-625 | $ 6,809 |
| s2 - 200 | 1 | 2 x200型 | 3300 - 4100 | 667-833. | 12142美元 |
| s2 - 200 Xp | 2 | 2 x100 | 1650 - 2050 | 333 - 416 | 6232美元 |
| s2 - 100 | 1 | 1 x100, 2×50,26 x91 或者28 x91 |
3300 - 4100 | 333 - 417 | 9718美元 |
| S2-100 XP. | 2 | 1 x100, 2×50,26 x91 或者28 x91 |
1650 - 2050 | 166 - 208 | 5026美元 |
| s4 - 300 | 1 | 2x150 | 8000 - 10000 | 2400 - 3000 | 19134美元 |
| s4 - 300 Xp | 4. | 2x150 | 2000-2500. | 600 - 750 | 5248美元 |
| s4 - 200 | 1 | 2 x100 | 8000 - 10000 | 1600-2000 | 16,462美元 |
| S4 200 Xp | 4. | 2 x100 | 2000-2500. | 400 - 500 | 4367美元 |
* ATGC不保证调查员的产出编制图书馆
* *请参阅价格单对于当前的外部或GCC定价。
HiSeq4000 -Illumina Hiseq4000是一种中等通量测序器，由两个8通道流单元组成。流单元可以独立运行，也可以并行运行。每个流程每次运行的最大输出容量为750 Gb，或每150 bp配对端道的最大输出容量为93.75 Gb。
| 读取长度 | 每车道估计产量 | 价格每车道* |
|---|---|---|
| 50个读 | 13.1 Gb | 1272美元 |
| 75BP配对结束 | 40.63 Gb | $ 2,122 |
*请看价格单对于当前的外部或GCC定价。
NextSeq500 -Illumina NextSeq 500系统是唯一能够在单次运行中测序30x人类基因组的唯一桌面下一代测序（NGS）系统。两个流单元格式和多种试剂配置使得在单个运行中使数据从20-120 GB输出，在广泛的应用中提供灵活性。它具有简单的工作流程和快速运行时间，可以快速地测序展开，转录om和全基因组。NextSeq 500序列仪在高输出配置中产生高达4亿个群集，在高输出配置中通过过滤器（最多120 GB），在MID输出配置中通过滤波器（最多40 GB）的13亿个群集。
| NextSeq500 Sequencing-per运行 | 每次运行估计输出 | 约。SE每次读取 | MD安德森价格* |
|---|---|---|---|
| 高输出 | |||
| 75年老 | 25 - 30 Gb | 4亿年 | 1839美元 |
| 75年体育 | 50 - 60 Gb | 4亿年 | 3271美元 |
| 150年体育 | 100 - 120 Gb | 4亿年 | 4934美元 |
| 中产量 | |||
| 75年体育 | 16 - 19 Gb | 1300万 | 1415美元 |
| 150年体育 | 35-39 Gb | 1300万 | 2099美元 |
*请看价格单对于当前的外部或GCC定价。
MiSeqIllumina MiSeq是一款低输出测序器，每次仪器运行可生成高达15gb的数据。它在Illumina的序列中具有最长的读取长度，每300个bp的配对端运行产生多达600个碱基。在这个单一的样本平台上，各种流单元和读取长度提供了灵活性。
| 流细胞类型 | 最大输出 | 约。SE每次读取 | MD安德森价格* |
|---|---|---|---|
| MiSeq150 V3 | 3.8 Gb | 20 - 2500万 | 1,138美元 |
| miseq600 v3 | 15 Gb | 20 - 2500万 | 1850美元 |
| MiSeq300 V2 | 4.5 5 Gb | 10-15万 | 1296美元 |
| MiSeq500 V2 | 7.5 8 Gb | 10-15万 | 1485美元 |
*请参阅当前外部或GCC定价的价格列表。
总会在应用程序
转录组分析
转录组分析可以是定量的(基因表达分析)和/或定性的(转录本发现、剪接变异鉴定、编码SNP验证、基因融合)。ATGC为转录组分析提供了几种选择。样品制备方法的选择要根据样品的质量、数量和研究者的实验目的而定。
核糖核酸 应用程序 |
|||
|---|---|---|---|
| 应用程序 | FFPE兼容 | 链的具体 | 应用笔记 |
| RNA外显子组(RNA通路) | 是的 | 是的 | FFPE样品的人mrna测序-从总RNA中生成cDNA，然后捕获外显子区。该协议是优化的RNA测序从降解或FFPE样本和样本与有限的起始材料。RNA-Access能够发现新的特征，如可变剪接、融合转录本、编码剪接变异和定量基因表达分析。基于捕获的方法覆盖了RefSeq外显子组的98.3%。人类只有 |
| 困mRNA-Seq | 没有 | 是的 | 使用oligo dT为基础的捕获Poly富集，然后使用随机和oligo dT引物cDNA合成。生成的序列映射到基因组的编码区域。 应用程序：基因表达定量，融合，剪接变异-仅Poly A转录本 |
| 链球菌总RNA-SEQ |
是的 | 是的 | 这里执行rRNA耗尽(不富集Poly A)，然后利用寡聚d(T)和随机六聚体合成cDNA。该方法可以对mRNA和非聚腺苷化RNA进行测序，包括组蛋白mRNA、Cajal体相关小RNA前体和lncrna。序列映射到外显子和基因间区域。 应用程序：基因表达,lncRNA。更完整的转录组与Poly A和非Poly A转录本 |
| 低输入mRNA-SEQ |
没有 |
没有 |
mRNA- Seq用于总RNA <100ng的高质量样品 |
| 低输入总RNA-Seq | 是的 | 是的 | 总RNA <100ng的样本的总RNA测序 |
| 小rna测序，包括miRNA-Seq | 是的 |
没有 |
miRNA表达量化。该协议将独特的分子条形码(UMIs)集成到逆转录反应中，使成熟mirna的无偏和准确的mirnome范围定量。UMIs需要75SR测序。 |
| 细胞受体a / b剖析 | 没有 | 没有 | TCRα和β靶向测序 |
| RNA捕获 | 自定义应用程序 | ||
| RIP-Seq | 没有 | 没有 | 研究者提供免疫沉淀RNA |
注意:链特异性保护链信息。链特异性可以用来识别反义转录本，确定非编码rna的转录链，并可能有助于确定重叠基因的边界。
| DNA的应用程序 | ||
|---|---|---|
| 应用程序 | FFPE兼容 | 应用笔记 |
| 安捷伦外显子组V7 | 是的 | SureSelect Human All Exon v7是一种全面的外显子组，使用RefSeq(99.3%覆盖率)、GENCODE(99.6%覆盖率)、CCDS(99.6%覆盖率)和UCSC Known Genes(99.6%覆盖率)的最新版本设计。设计尺寸:48.2 Mb |
| 安捷伦临床研究外显子组乐动体育LDsports中国 | 是的 | SureSelect临床研究Exome V2是一乐动体育LDsports中国个全面的医学外壳，整体封面覆盖，增强了与疾病相关的基因的覆盖率，增加了HGMD，OMIM，Clinvar和ACMG目标的覆盖率。相关的基因列表包括基因名称和疾病相关性的证据。设计尺寸：67.3 MB |
| T200.1面板 | 是的 | 263基因实体瘤面板。涵盖了所有外显子。 |
| ChiP-Seq | NA | 用于识别基因组和特定细胞类型中的转录因子(蛋白)结合位点。研究者进行染色质IP，并将捕获的DNA抗体提供给ATGC。库需要至少10ng的免疫沉淀DNA。最大大小500个基点。浓缩应该是10倍或更大。需要“输入”DNA进行分析比较。 |
| 针对CapturE. | 是的 | 自定义应用程序。选择性地丰富和序列研究者定义的感兴趣的区域。ATGC使用基于杂交捕获探针和基于扩增子的富集方法(Illumina, Haloplex和Qiagen设计)提供定制的目标捕获。该设备使用T200.1面板。 |
| 全基因组-Seq. | 没有 | 人类，老鼠，大鼠，酵母，猴子，病毒，细菌和其他基因组。对于癌症研究的应用，ATGC提供匹配的肿瘤和正常样本的乐动体育LDsports中国测序。 |
开始
项目咨询
ATGC与一名NGS专家和一名MD Anderson教授生物信息学家一起提供预算规划、技术咨询和项目规划。我们强烈建议首次使用大型项目的NGS服务用户和调查人员在项目启动前安排一次会议。如需安排咨询会议，请与Erika Thompson联系ejthomps@mdanderson.org．
样品提交
所有样本必须附有一份完整的样本提交表格。样品提交要求(最小数量和推荐序列长度)因服务和样品类型而异。
数据分析
生物信息学教员的合作者
- 小平苏,博士学位。
将表单提交
NGSsubmissions@mdanderson.org
Sanger-based DNA测序
ATGC提供单链或双链DNA测序，从纯化质粒，PCR产物和BACs。测序主要在ABI 3730XL和3730 DNA测序仪上进行，使用大染料终止循环测序化学。该设备对所有样品进行量化，进行测序反应、清洗和毛细管电泳，分析数据，并以文本文件和色谱图的形式提供序列。
查看我们服务定价时间表查阅更多有关DNA测序定价的资料。
周转时间:24 - 48小时(工作日)
当我们的样品量非常大时，当要求特殊条件时，当我们遇到仪器问题时，可能会出现较长的周转时间。
提交DNA指引
样品提交需求
质粒浓度必须为100 ng/µl。每次反应提交10µl。定制引物必须在1pmol /µl。每次反应提交10µl。DNA和引物必须在0.5 ml的Eppendorf试管中提交，试管的侧面和顶部写有样品名称。BAC DNA以500 ng/µl的浓度提交，引物以25 pmol/µl的浓度提交。对于小于1 kb的产物，应以20 ng/µl的浓度提交PCR产物。1 kb或更大的产品应以30 ng/µl的质量提交。每次反应提交10µl
DNA定量
所有提交给医院的DNA都需要精确定量。我们推荐使用定量DNA梯子在琼脂糖凝胶上目视测定DNA的质量和数量。也可以用荧光法测定DNA浓度。由于RNA、蛋白质、细菌基因组DNA和其他污染物的存在，用分光光度计测定的DNA浓度通常人为地很高。
注:低DNA浓度是导致序列质量差和反应失败的最常见原因。然而，过多的DNA可能和过少的DNA一样有害。太多模板的存在会导致头重脚轻的数据(开始时有很强的峰值，但很快就会消失)、上拉峰值(出现在正确峰值以下的非特定峰值)和峰值分辨率的损失。此外，它缩短了我们毛细血管的寿命。
定制的测序引物设计指南
- 热循环条件：变性步骤加热反应混合物至96℃。退火步骤冷却反应混合物至55℃，聚合步骤在60℃下延伸。引物必须具有56℃或更高的退火温度。
- 底漆长度至少为20- 25米。GC含量应达到50%或以上。
- 引物应设计成3'端紧密结合。
- 在设计底漆时，请勿选择与感兴趣区域更近于50个基础的区域。
- PCR反应的引物在自动测序中往往很有效。
ATGC提供的测序引物
该设施目前免费提供以下引物：
- coreT3:CCT cac taa agg gaa caa aag c
- coreT7:TAA TAC GAC TCA CTA标签GGC GA
- coreT30:Att aac CCT cac taa agg ga
- CORET70：Taa tac gac tca cta tag gg
- coreM13F:Gta aaa CGA CGG cca g
- coreM13R:a、c、c、c、c
- coreSp6:我们应该采取行动
- CoreBluescriptks：TCG agg TCG acg gta等
- coreBluescriptSK:CGC TCT aga act agt gga tc
- coreBGHRev:标签aag gca cag TCG agg
- corePCMVFor:CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG
- corepGEX3:CCG gga GCT gca TGT GTC aga gg
- corepGEX5:GGG CTG gca agc cac GTT TGG tg
- CORET7TER：GCT与TGC相同
重做的政策
如果仪器出现故障，或者由于仪器的错误导致序列质量下降，实验室将免费重复取样。如果研究者建议重复一个样本，将使用相同的DNA和引物重复测序反应。如果第二次反应失败，研究者将因重复反应而被起诉。如果要求测序的引物不正确，导致测序反应没有产生序列数据，费用由研究者承担。
该设施将协助研究人员设计用于困难地区的引物。如果您需要这项服务，请与Erika Thompson联系
常见问题
查看答案常见问题例如:为什么我的模板没有排序?为什么我要在水中再悬浮?宿主菌株重要吗?我用什么培养基来培养细胞有关系吗?为什么我的序列突然停止了?
访问结果
下载序列
*注意：文本序列为您提供未编辑的原始序列数据。请查看色谱图以纠正由基本呼叫软件制作的轻微错误。测序和微阵列设施为主要调查人员提供了快速分散的服务器。结果在服务器上留在30天后，之后将自动删除文件。调查人员应该将所有数据复制到其驱动器。
AppleShare
当使用AppleTalk时，服务器一次只允许20个用户登录。服务器设置为允许每个用户登录15分钟下载文件。如果您的工作站在启动时自动登录，您将在15分钟后退出系统。
（如果您没有在线文件夹，请联系ATGC，我们将为您创建一个文件夹。）
获取在线测序结果的新方向
个人电脑用户:
- 点击“开始”
- 点击“运行”
- 输入“\ \ mymdafiles \ seq”
- 单击“OK”
- 将出现一个对话框。输入你的“用户名”和“密码”。
Macintosh用户：
- 点击“Go”（位于屏幕顶部）
- 点击“连接到服务器”
- 输入“smb: / / mymdafiles / seq”
PC和Mac用户使用的用户名和密码与你通过Entourage和/或Outlook访问MD Anderson账户时使用的用户名和密码相同。
查看色谱图(免费下载软件)
个人电脑用户:
色软件:http://technelysium.com.au/wp/chromas
Mac用户:
4峰软件:http://downloads.nucleobytes.com/4peaks
基于Sanger的基因重新排列
基于桑格的基因重测序可以通过在单个实验中评估整个基因或单个SNPs来检测基因突变。ATGC使用定制的引物进行此分析。查看可用基因对于这个服务。
查看服务定价时间表有关基因重测序定价的更多信息。
服务亮点
- 定制可用
- 免费提供新的化验设计
- 黄金标准新一代测序验证
仪表
定量是在量子位荧光计上进行的。测序使用3730XL DNA分析仪(Thermo)进行，比较分析使用SeqScape软件(Thermo)。
示例工作流
- 样品的量化和标准化
- PCR扩增和纯化
- 两个方向的桑格测序(如果可能)
- 与参考序列的比较对齐
- gacvs(如果需要)
- 发现所有突变的报告以及发送给客户的所有序列
样本提交
发送完整的提交表格到D.J.床铺或使用样品提交硬拷贝。样品可以在1.5或0.5微量离心管中提交，名称清晰地写在管顶部。所需的GDNA的量取决于所要求的基因，请联系D.J.DOSS更多信息。
附加信息/文件
调度样品下降
联系D.J. Doss安排样品的递送，并确定所需gDNA的数量。
有关新的分析设计，请联系D.J. Doss或Erika Thompson。
联系信息
D.J.床铺
电子邮件:djdoss@mdanderson.org
埃里卡·汤普森
电子邮件:ejthomps@mdanderson.org
单细胞分析
提交样品进行10X单细胞处理
项目咨询-我们强烈建议在开始您的第一个10X基因组学项目之前召开一次咨询会议。调查人员可以利用ATGC的单电话服务免费进行咨询。要求开会，请与大卫·波洛克(dpollock@mdanderson.org.)或艾丽卡·汤普森(ejthomps@mdanderson.org)．
安排你的实验-单电话业务只能通过预约。在提交样品之前，您必须有一个预约。提交预约应至少提前一周，你的预期提交日期。这可以防止计划冲突，并确保适当的试剂是可用的，并在正确的温度下立即使用(当我们将试剂带入温度时，样品处于静置状态可能会对数据产生负面影响)。我们将尽力安排提交前24-48小时的预约，但我们不能保证可用。
要安排提交预约，请联系David Pollock（dpollock@mdanderson.org.)．
样品提交-如需提交样本，请填写一份10X Genomics单细胞服务申请表，并将填妥的表格(带有有效账号和适当签名)通过电子邮件发送给David Pollock(见上面的电子邮件)。对于外部调查人员，除了服务请求表单之外，还需要一个附加的具有PO#和PI签名授权的外部账单表单。
单个细胞的应用程序
3’scRNAseq基因表达谱分析
应用程序突出了
- 基因表达分析。
- 每台井分区芯片捕获多达10,000个细胞
工作流程,单细胞、带有特定条形码和通用分子标识符(UMI)的RT引物珠，以及裂解和RT试剂被分割成油滴，在油滴溶解和细胞被裂解以进行反转录。然后将液滴破碎，并放大汇集的单链条形码cDNA，并将其片段用于文库制备。在文库制备过程中，添加适当的序列引物位点和适配器，使最终产品包含10X条形码、UMI、适当大小的cDNA插入和带有P5和P7引物序列的Illumina适配器，用于Illumina测序器(通常为NovaSeq6000或NextSeq500)上的测序。
5’scRNAseq基因的免疫表达
应用程序突出了
- 人类和小鼠样本的基因表达谱与添加免疫谱T细胞TCR和B细胞Ig的能力。
- 每个分区芯片井捕获多达10,000个单元。
工作流程,5 '基因表达的工作流程与3 ' scRNAseq类似，在cDNA扩增完成后，附加的能力是富集在T细胞或B细胞中表达的V(D)J片段。这提供了从同一细胞悬液中运行基因表达谱、TCR谱和Ig谱的能力。
喀拉特卡塞克
应用程序突出了
- 单细胞开放染色质区域的确定，以理解表观遗传和整个基因组的调节变异。
- 每孔分割芯片可捕获多达10,000个核。
工作流程,单细胞ATAC分析用于评估染色质在单个细胞水平上的可及性。在这个工作流程的第一步，单核从单细胞悬液中分离出来。接下来，在第一步生成的细胞核经过转座酶酶反应，可访问的DNA区域被片段化，并与测序适配器标记。转位后的细胞核被划分为GEMs，每个细胞核都被单独编码，并准备用于文库准备。
scCNV DNAseq
应用程序突出了
- 单细胞CNV事件和罕见克隆的检测。
- 每个分区芯片井可捕获多达5,000个单元。
工作流程,该工作流程的第一步是将单个细胞在水凝胶基质中分割，在微流控芯片中生成细胞珠。细胞珠被处理以溶解捕获的细胞和变性的基因组DNA (gDNA)。在另一个微流控芯片上，GemCode技术采集约750,000个10x条形码，分别索引每个细胞的gDNA。它是通过将细胞珠分割成纳米升级的乳胶凝胶珠(GEMs)来实现的，其中所有的片段共享一个共同的10倍条形码。生成库并对其进行排序，并使用10x条形码将各个读操作关联到各个分区，从而关联到每个单元。
有关以上申请的更多信息，请访问10X基因组学网站:www.10xgenomics.com
样品需求
样本类型-样品应按如下方式提交单个细胞悬浮液在1.5毫升微型管中。在提交之前，应在提交前（通过调查人员去除来自组织和除去显着细胞碎片的细胞解离和去除显着的细胞碎片。
福尔马林固定细胞不适合用于任何10X基因组学协议。
细胞浓缩,通过流式细胞术、磁珠阳性或阴性细胞筛选等。应由提交的调查员在样品提交前执行。
可行性- 最佳存活率> 90％，但可接受70-90％的能力。可以冷冻保存（在冷冻保存前的活力> 90％），然后在以后提交的可活性细胞悬浮液。请注意，先前冷冻保存样品的可行性可能会有所不同。低生存能力可能对细胞捕获的效率和测序数据产生负面影响。
缓冲区,单细胞悬液3 '或5 ' scRNAseq服务可以通过这两种方式提交1 x PBS (bsa≤0.04%是10X genome推荐的理想缓冲液）或者，对于更敏感的细胞，培养基．请注意，介质中的添加剂会影响捕获效率。至少，EDTA/EGTA应该被排除在培养基之外，因为它会抑制下游的酶步骤。如果带的样品在PBS中，细胞应该是新鲜收获的(提交前的最短运输时间);否则，介质中的细胞可能更好，这取决于细胞在系统外的持续时间或细胞悬液在非介质环境中的敏感性。胎牛血清允许在PBS或培养基中，但不应包含超过10%的胎牛血清(5%或更少为佳)。
为喀拉特卡塞克和scCNV DNAseq细胞悬液应提交1 x PBS．我们不推荐任何应用程序使用媒体。
免费核酸-如果样本被怀疑含有如果不污染游离核酸(来自死亡、死亡或溶解的细胞)，我们建议您将其从细胞悬浮液中移除(在4摄氏度下，300-500XG离心5分钟)，同时用新鲜PBS/培养基清洗1-2次。游离核酸的存在会对细胞捕获的效率以及测序数据产生负面影响。
细胞浓度
3 '或5 ' scRNAseq- 在100-200uL的PBS /培养基中，最佳细胞悬浮浓度为700-1200个细胞/ UL（700,000-1,200,000个细胞/ ml）。但是，我们可以运行较低的电池数量（我们已成功运行细胞<10,000）。对于低电池量，所需的细胞体积最大为10-30μl。
喀拉特卡塞克，-此应用的细胞输入是100000 - 1x10 ^6细胞，在400-500 uL的PBS。在100-200 uL的PBS体积中，允许较低的细胞输入范围为2000 -40,000。
scCNV DNAseq-这种应用对浓度的要求通常较高，而工作体积较低。最佳浓度为1000-4000 cells/uL。可能需要更高的浓度来获得此应用程序的最大(5000)细胞计数。
测序要求
10X Genomics对每个应用程序都有最小的读取/细胞建议。这些是非常宽泛的指导方针，可能不能满足您具体项目的需要。我们强烈建议您咨询您的生物统计学合作伙伴，以确定所需的细胞数量和读取每个细胞，以满足您的特定实验目标。
下表概述了ATGC对每个应用程序的读对/单元数的一般建议。这张表只是作为测序覆盖范围的指南。
| 应用程序 | ATGC阅读建议 (最低的建议) |
|---|---|
| sc 3' RNAseq V3 | 50000读双/细胞 |
| sc 5' RNAseq基因表达 | 50000读双/细胞 |
| SC 5'RNASEQ VDJ浓缩 | 10000读双/细胞 |
| SCDNASEQ CNV. | 800000读双/细胞 |
| 喀拉特卡塞克 | 50000读双/细胞 |
单细胞测序通常在Illumina NovaSeq6000或NextSeq500测序仪上进行。这两种测序仪允许灵活性，提供各种流单元格式选项，以满足您的测序要求。对于单细胞实验来说，测序器和流细胞格式的选择取决于提交的样本数量和目标细胞对每个样本的捕获要求。对于高样品量或复杂的样品库库，我们将使用iSeq100预筛选适当的样品测序分布，然后对更高密度的流细胞进行测序。
数据输出
ATGC只提供由我们的服务产生的原始数据。使用10X Genomics的特定软件将Base Call文件(bcl)转换为fastq文件。修改的fastq文件用于QC度量(html文件)和测序数据的解复用使用10X基因组学应用管道软件。分析文件是使用10X Genomics Pipeline软件创建的，可以使用免费的分析软件从10X Genomics下载。
请参阅ATGC价格列表上的单个小区服务和测序定价。ATGC价格表．