RPPA过程

RPPA方法和数据处理

用RPPA裂解缓冲液裂解冷冻肿瘤/细胞微球，提取蛋白(见抗体信息及协议页）。裂解物手动串行稀释在5用裂解缓冲液2倍稀释液和印刷在使用Aushon Biosystems公司2470点样仪硝化纤维素包被的载玻片。载玻片用大约300验证初级抗体，接着用与检测生物素化的适当的二抗（山羊抗兔IgG，山羊抗小鼠IgG或兔抗山羊IgG）的探测。所获得的信号，使用抗生物素蛋白 - 生物素化过氧化物酶（来自Vector实验室的Vectastain ABC精英试剂盒）的Cytomation公司催化系统结合于二次抗体和催化酪胺 - 生物素缀合，以形成不溶性的生物素化的酚扩增。信号分别由二次链霉抗缀合HRP和DAB显色反应可视化。将载玻片扫描，分析和使用阵列的Pro分析器软件（MediaCyber​​netics）来产生斑点强度（级别1数据）进行定量。SuperCurve GUI（2），来估计相对蛋白水平（在LOG2刻度）。甲拟合曲线（“supercurve”）与在Y轴的信号强度和在每种蛋白的相对量的log 2生成的X轴使用非参数化的，单调增B样条模型（1）。使用跨越幻灯片（3）排列的“控制点”模型拟合之前的原始斑点强度数据进行了调整，以正确的空间偏差。甲QC度量（4）对每个幻灯片，以确定滑动质量和仅载玻片用0.8上的0-1规模进一步用于生成。 For replicate slides, the slide with the highest QC score was used for analysis (Level 2 data). Protein measurements were corrected for loading as described (2,5) using median-centering across antibodies (Level 3 data). Samples with low protein levels were excluded from further analysis. Antibodies were selected to represent the breadth of cell signaling and repair pathways (7) conditioned on a strict validation process as previously described (6). Antibodies are labeled as “validated” and “use with caution” based on degree of validation.

1.等人。反相蛋白阵列:一种新的蛋白质组学技术的验证和分析原发性白血病标本和造血干细胞的效用。《其他癌症》5,2512 -2521 (2006)

2.Hu J, He X, Baggerly KA, Coombes KR, Hennessy BTJ, Mills GB。(2007)蛋白质裂解物阵列的非参数量化。生物信息学,23岁,1986 - 94。

3.尼利ES，Baggerly KA，Kornblau SM。（2012），使用阳性对照斑点反相蛋白质阵列的表面调整。癌症通知。11，77-86。

4.Ju z等。一种鲁棒分类器的发展质量控制的反相蛋白质阵列。生物信息学31,912 -918 (2015)

5.冈萨雷斯-安古洛，A.M.等。功能蛋白质组学可以确定乳腺癌患者的预后和预测病理完全缓解。中国。蛋白质组学8 - 11 (2011)

6.轩尼诗，柯氏等。反相蛋白阵列在非显微人类乳腺癌的功能蛋白质组研究中的实用的技术评估。中国。蛋白质组学6，129-151（2010）

7. Akbani R.，吴KS，沃纳HMJ，Shahmoradgoli M.，张楼，鞠。Z.，刘W.，杨JY，吉原K.，李J.，凌秒。Seviour EG，拉姆PT。明娜JD，刁L. P.通合资Heymach，山SM，DondelingerF.，施泰德N.，拜尔斯LN，梅里克 - Bernstam F.，温斯坦HN，扫帚BM，Verhaak RGW，梁H.，慕克吉S.，鲁Y，和米尔斯GB，2014年泛癌在癌症基因组图谱自然通讯科蛋白质组学透视：5：3887 PMID：24871328 PMC4109726