标准操作程序 - 北校区

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试剂

• histopaque-1077（西格玛＃1077-1）
• 磷酸盐缓冲盐水(PBS)

过程

1. 加入15ml锥形离心管，加入5.0 mL组织盖-1077并带到室温。
2. 在单独的15ml管中制备样品混合物：将5ml血液/骨髓混合用5ml PBS混合。
3. 将血液/骨髓精细地覆盖在组织液上。在没有刹车的室温下，400xg离心20分钟。
4. 单核层作为位于两个解决方案之间的界面处的白色阴天层可见。小心地吸出与巴斯特移液管的界面并转移到另外的15ml管中。
5. 用PBS填充试管，500 x g离心5分钟。
6. 吸出上清液并丢弃。
7. 用5.0ml PBS重悬细胞沉淀并重复步骤5和6。
8. 丢弃上清液并将细胞颗粒重悬于1ml PBS中。
   

试剂

• 组织盖1119（Sigma＃1119-1）
• 组织大小1077（Sigma 1077-1）
• 磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）

过程

1. 将3ml组织型1119加入15ml锥形离心管。
2. 小心地将3ml的Histopaque 1077涂到Histopaque 1119上。
3. 仔细层6毫升的全血在管的从步骤2的上坡度。
4. 常温下700 x g离心30分钟。
5. 小心地拆下离心管。应该观察到两个不同的不透明层。
6. 吸气并丢弃流体到0.5cm的层A内。将细胞从该层转移到标记为“单核细胞”的管中。
7. 将剩余液体抽吸并丢弃到b层0.5 cm内，将细胞从b层转移到标有“粒细胞”的管中。
8. 通过加入10mL PBS洗涤细胞。离心10分钟以500 x g。取下上清液并丢弃。
9. 通过用巴斯特移液管通过温和抽吸重悬细胞。
10. 重复步骤8和9。
11. 根据需要重悬细胞在PBS适当体积和使用。
    

非固定裂解溶液

氯化铵Lyse

10x浓度

用90毫升双蒸馏水稀释10毫升高汤。存储在4°C。

• NH4Cl（氯化铵）80.2g
• NaHCO 3（碳酸氢钠）8.4g
• EDTA（二钠）3.7克

工作解决方案

QS到1升双蒸馏水。在4°C存储股票长达六个月。

过程

1. 获得在一个10毫升肝素化管中的整个样品，优选不含防腐剂。
2. 将2mL等分为四个50ml锥形离心管中的每一个。
3. 立即填料管高达50毫升用冷的裂解1X溶液。
4. 在室温下摇10分钟。
5. 以250×g在4℃下旋转10分钟。
6. 倒存上清液并允许管道短暂排出。
7. 通过拖管穿过管架重悬颗粒(即，刮颗粒)。
8. 结合两种粒料到一个50毫升管中。填充10毫升的冷PBS洗。
9. 如上所述，旋转，倾析和刮去颗粒。
10. 将两种微丸合并到一管中，用10ml冷PBS清洗。
11. 旋转，倾析和刮去颗粒。根据需要使用单元格。

注意:这种渗透裂解方法不会损害白细胞或改变膜不对称。由于渗透溶解方法，10倍的原料必须用水稀释至1倍。使用诸如PBS的缓冲液改变裂解缓冲液的渗透性，它将不再有效。该裂解技术将使所有白细胞的所有群体留下，包括粒细胞。

贡献：弗吉尼亚州Snell.

进一步阅读：从流式细胞术方式修改，J.Paul Robinson，编辑，Wiley-Liss Inc.

所有实体组织的流式细胞术研究的一个共同特点是在染色和分析之前需要分散到单个细胞(或细胞核)。流式细胞术分析固体肿瘤的分散可以通过多种方法实现，其中大多数采用机械和酶解的结合。分散方法的选择取决于被测材料的类型和被测点。此外，以下情况需要特殊处理:

血型计电网系统

引起误差的原因有很多:稀释误差、移液过程中细胞的损失、细胞悬浮不均匀、腔室的充盈或充盈不足以及沉淀前细胞的计数。室中细胞的随机分布是误差的另一个来源，但可以通过计算大量细胞来补偿。在使用前和使用后都要进行清洁。如果腔室负荷过重，清理它并重新开始;不要试图去除多余的液体。

例:台盼蓝1:1稀释细胞悬液

网格#1(16个方格)= 195个单元格
网格＃2（16个方格）= 177个细胞
网格＃3（16个方格）= 204个细胞
网格＃4（16个方格）= 166个细胞

总= 742个细胞
平均值= 185.5细胞

公式：细胞浓度（细胞/ ml）=平均X（10）x稀释因子
= 185.5 x（104）x 2
= 3.71 x 106细胞/mL

1. 通过在水浴中在37℃下简要孵育管，快速解冻冷冻小瓶细胞，直至样品只是倾斜。用70％乙醇擦拭管。
2. 将样品转移到含有10-13mL RPMI 1640的15ml锥形管，将培养基温热至37℃。
3. 立即以800×g离心细胞。去除上清液。
4. 用10mL RPMI洗涤电池2x完成。离心细胞。
5. 在所需的缓冲液或培养基中重悬细胞，并根据需要使用。

注:DMSO是一种极性平面分子，它不仅是一种分化剂，而且对细胞具有毒性。这种毒性在温暖的温度下表现出来。因此，尽快将细胞从冷冻培养基中取出是非常重要的。这是通过立即将解冻的细胞悬液稀释到大量的培养基中，并离心细胞以去除稀释的DMSO来完成的。

1. 使用无菌方法Lyse RBC或Ficoll细胞。用冷菌培养基洗涤细胞1x。
2. 在冷培养基中重悬细胞。计数细胞。离心机样品。
3. 细胞应在10-20×10 6个细胞的等分试样中冷冻。将颗粒重悬于每管500μl冷培养基中。
4. 带有适当信息的Label Cryotubes：

细胞系：

细胞系的名称
日期
段落号码（如果已知）
的细胞来源
细胞的数量

主要的组织:

姓氏和患者的第一个首字母
MD安德森数量
日期
诊断
组织型（BM，PB，pH）
治疗（F = Ficolled，L =裂解）

5.在轻轻旋转的同时，在RPMI下降中加入等量的冰冻介质（配方以下）。RPMI细胞悬浮液与冷冻介质的比例应始终为1：1。
6.将1ml所得细胞悬浮液加入适当的低温。把管放在冰上。

用于在-70°C的冰柜中冷冻

1. 将管子放入冷冻框中，该管已被冷却至4°C。
2. 将冷冻仪放入-70°C冰箱中。
3. 第二天将冷冻瓶移到液氮冰箱中。
4. 在冰箱中存放空冰冻。
5. 在受控冰箱中冷冻:
   你可能需要一个先导管作为内部控制的程度冰柜。冷冻处500µL RPMI和500µL冷冻培养基。用准备好的试管放在冰上。
   度冷却该冷冻推程腔室至4℃。
   将冷冻瓶放入腔内。冷冻过程大约需要一个小时。
   立即将试管移到液氮冷冻器中。

冷冻媒介

40毫升汉克缓冲盐水溶液(HBSS) - Ca+2， - mg +2
20毫升DMSO溶液
40毫升胎牛血清
100毫升

注:DMSO是一种极性平面分子，它不仅是一种分化剂，而且对细胞具有毒性。这种毒性在温暖的温度下表现出来。因此，将DMSO添加为最后一步是非常重要的，在添加DMSO时保持冰上的细胞，并尽快开始冷冻过程。DMSO通过防止细胞内的水结晶并爆裂脂质膜来保持细胞在冷冻过程中可行。

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评估碘化钛表面标志物的细胞周期表达，从染色所需样品的标准程序及其同种型对照开始。然后必须在备受沉备之前固定细胞，并且可以使用两种方法：乙醇或多聚甲醛基固定。所用方法应取决于要测量现象的重要性。乙醇固定可以为调查仪提供优异的CV用于DNA分析，而多聚甲醛技术随后是乙醇而言，最好保留表面标记荧光。

1. 基于乙醇的固定：
   
   加入0.7 mL冰点100%乙醇至1 × 10^6.染色的细胞在含有0.3毫升冷的PBS中。孵育在-20℃下30分钟或过夜。离心和去除上清液。
   
   或者,
   
   多聚甲醛固定:
   
   在PBS中加入0.5ml 2％多聚甲醛至1 x 10^6.染色细胞在0.5mL PBS中。在4℃下孵育30分钟。用冷PBS离心和洗一次。样品可以立即染色或在4°C下储存长达一个月。
   
   
2. 添加250μL的500个单位/ ml RNA酶的PBS中与1.12％柠檬酸钠到细胞沉淀。轻轻涡旋并温育在37℃下30分钟。
3. 将250μl碘化钛（Sigma）加入50mg / ml以样品。在黑暗中在室温下孵育至少1小时。
4. 在流式细胞仪上读取样本。

1. 2 x 10.^6.细胞用标记的任一FITC，PE或PERCP两种单克隆抗体。按照标准程序与表面标志物染色。并行处理适当的同型对照。
2. 在4℃下用0.5％多聚甲醛（1mL）固定30分钟30分钟。
3. 500 x g离心5分钟。
4. 室温下用0.1% Triton-X-100 (PBS)重悬细胞3分钟。
5. 离心细胞并用PBS洗涤两次。
6. 加入DAPI，最终浓度为1µM;孵育1小时或在黑暗中过夜。

试剂

• 库存溶液AO：1 mg / ml
• 磷酸盐 - 柠檬酸缓冲液（pH6.0）
  • 37毫升0.1M柠檬酸
  • 63 mL 0.2 M Na₂HPO._4.
• 解决方案A.
  • Triton X-100 (0.1% final)
  • 8.0 ml 1N HCl（0.08 n最终）
  • 0.877 g NaCl（0.15 n最终）
  • qs到100毫升与dh₂O.在4°C，黑暗中保存6个月。
• 溶液B
  • 100毫升磷酸盐柠檬酸缓冲
  • 0.877克的NaCl（0.15M最终）
  • EDTA二钠(1mM final)
  • 0.6 mL原液AO(20µM)
  • 在黑暗中以4°C存储6个月。
  • 用于分配瓶使用0.4 mL的溶液A和1.2 mL的溶液B（在箔包裹瓶）
• 核隔离介质：
  • 10 mm tris缓冲液（pH 7.6）
  • 1mM的柠檬酸钠
  • 2毫米MgCl₂
  • 0.1％（V / V）非离子洗涤剂Nonident P-40

染色未固定的细胞

1. 转移200μL细胞悬浮液（至多2×10^5.细胞)到流式细胞术管。
2. 冰上寒冷。轻轻加入400μl溶液并在冰上等待15秒。
3. 在接下来的3-15分钟内轻轻加入1.2ml冰冷溶液B并测量细胞发光。

固定细胞

1. 在4°C的70%乙醇中固定细胞。
2. 洗涤细胞（250×g，10分钟）两次，以在2×10除去乙醇，重悬在PBS中^6./ ml。
3. 用上述溶液A和B对200µL细胞悬液进行染色。(Triton X-100对于固定的细胞是没有必要的)。

为了估算反应的特异性，取出乙醇并重新悬浮在PBS中的细胞。在AO染色之前，在37℃下与RNase（103u / ml）孵育30分钟。与未与RNase治疗的样品进行比较。

注1：AO浓度至关重要。如果单元号高（> 2 x 10^6./mL)，结合AO的量比例较高，游离染料可被降低。RNA变性可能不完全，有些RNA染色呈绿色。因此，稀释细胞悬液。

笔记2：如果测量是在喷嘴外(即在空气中)进行的，染料扩散是在气流离开喷嘴后进行的。这样可以降低AO的实际浓度。因此，在溶液B中增加AO浓度至60µM，并增加流速。重要的是要确定正确的浓度和流速的个别机器。

注3：过滤器:使用640或650纳米的长通过滤器，而不是610或620纳米的AO结合到RNA(减少DNA成分)。

注4:大多数商业仪器都很好。以下仪器需要更高的AO浓度（即，约25-60μm）来补偿染料扩散：FACS II，FACS II，FACSI，IV和C和30-H CytoFluorograf。

注5:对于ortho-50h，非分拣频道优于排序。

采集和分析

获取吖啶橙色的样品时，FacScan的双重鉴别（DDM）功能必须亮起。DDM设置将为FL1，因为AO荧光在与DNA结合时的荧光。AO的增益设置是在设置时的理想选择。很少需要调整这些增益。所获取的参数是线性模式下的FL1区域，FL1宽度，FL3高度，在日志模式下为FL1高度。五千个细胞通常足以进行此测量。

使用样品设置机器时，最好使用控制单元群。尽管细胞的散射特性通常在渗透后不感兴趣，但调整的第一个参数应该是SSC v。FSC以确保正在获取所有细胞，并消除不必要的碎片获取。调整的第二个设置应为FL1面积V. FL1宽度。它是传统的，g_0.-G₁在FL1区域，峰值设置在200左右。接下来，观察FL1高度与FL3高度或FL1面积与FL3高度，设置RNA (FL3)，使G_0.RNA水平更靠近左侧和g₂M RNA并没有延伸到右边，基本上是在屏幕的中心。此时样品可以获得，不需要或对其他样品进行少量调整。如果使用多个细胞系，可能需要分别调整不同的细胞系。“分析见”，显示FL1区域与FL1宽度。在背心周围做一个门。显示FL1高度与FL3高度，G上有逻辑门₁。制作另一个门以排除FL1高度的低倍底左下方的死区。在“门规范”上，将G3 = R3变为G3 = R1和R2。显示FL1高度的直方图，在G3上具有逻辑门控。您必须将逻辑盖板组合为R1和r2或门不会组合。在直方图的低倍解区域上制作标记。得到的百分比是百分比凋亡细胞。

贡献：弗吉尼亚州Snell.

进一步阅读：

用吖啶橙对完整细胞和离体细胞核中DNA和RNA的差异染色。《细胞生物学方法》第33卷。Z. Darzynkiewicz & H. Crissman编。纽约学术出版社，1990年。页285 - 298。

摘自《流式细胞术方法手册》，J. Paul Robinson, Wiley-Liss Inc.编辑。

该技术旨在检测M相细胞的基于不同细胞周期相中的细胞对部分酸性变性同等敏感。

1. 通过在玻璃管中加入4.5mL冷70％乙醇来固定500μLPBS中的10E6细胞。此时，样品可以存储在4°C以供将来使用。
2. 离心细胞，去除上清液并重悬于1mL HBSS中。
3. 用100μL高度纯化的RNase（例如，Worthington）稀释1：5000。在37℃下孵育45分钟。
4. 将200-μL等分试样混合在pH 1.4的0.1M KCl和0.1M HCl的500μL缓冲液中。
5. 加入2.0 mL 5µg/mL吖啶橙，加入0.1M柠檬酸，0.2M钠缓冲液₂HPO._4.在pH 2.6。
6. 在流式细胞仪上立即测量。

1. 标签细胞与IdUr或BrdUr以10微克/毫升的30分钟在37℃下的浓度。以1500rpm用PBS洗涤1X 5分钟。
2. 将颗粒重悬于70％乙醇中，同时轻轻涡旋以固定细胞。将细胞在4℃下储存至少24小时或最多一个月。
3. 分离细胞核:
   
   5 mL 0.025-0.01%胃蛋白酶(Sigma) w/v在0.01N HCl中孵育细胞1小时或在37°C的最佳时间。
   
   涡旋细胞悬浮30秒的单细胞悬浮液。对于实体肿瘤，可能需要通过18号针的细胞悬浮液并通过35微米尼龙网过滤。
   
   2000转离心5分钟(Sorvall Technospin)。
   
   
4. 在37°C的1ml 2N HCl中重悬颗粒20分钟。
5. 中和HCl，用2mL硫酸盐的2mL 0.1米（使用2×HCl体积）。以2000 rpm离心5分钟。在PBTB（2000 rpm / 5分钟）中洗涤2x。
6. 染色样品BrdUr：
   
   在150μLBrdur特异性抗体（CalTag）中重新悬浮2E6核，在黑暗的室温下在PBTB中稀释1：500V / V 1小时。[我们目前正在使用以1:10的浓度稀释的另一个来源（Dolbee）的BR3，以终浓度为1：500，因此使用稀释股1:50]。
   
   用PBTB清洗2X(2000转/5分钟)。
   
   在150μLGAM-FITC IgG抗体（Sigma）的重悬沉淀稀释在PBTB 1:50 V / V和孵育1小时在黑暗中在室温。
   
   用PBTB清洗2X(2000转/5分钟)。
   
   
7. IdUr染色样品:
   
   将2E6核在20μLidur / Brdur特异性B44-FITC抗体（Becton Dickinson）中稀释1：2 v / v在PBTB中，在室温下在黑暗中孵育1小时。
   
   用PBTB清洗2X(2000转/5分钟)。
   
   
8. 将10µg/mL PI重悬于2ml PBTB中。核悬浮液在4°C保存至少一个小时，最好隔夜。
9. 在10μg/ mL的终浓度下流动之前加入RNase 30分钟（37℃）。

笔记
显然，由于在该程序中使用胃蛋白酶来从细胞核中剥离细胞质，因此必须具有尽可能均匀的细胞群，因为细胞标识将丧失。还有其他不使用胃蛋白酶消化的方法，但这种方法给出了PI染色的最佳CV以及标记和未标记的idur和Brdur之间的最具分离。当需要细胞周期动力学的分析时，这些条件是理想的，例如潜在的倍增时间（TDPOT）和S相的持续时间（DS）。如果一个人只希望标记指数（用核苷类似物标记的细胞的百分比）和/或细胞表面染色，则另一种不使用胃蛋白酶消化的方法更合适。

几乎所有用Brdur或其他核形类似物染色方法使用相同技术的轻微变化。在所有方法中，第一步是用模拟标记单元格。介绍孵育方法，即使用脉冲或脉冲/追踪或多重标记。其次，该方法使用胃蛋白酶消化来从细胞核中剥离细胞质。在稀释HCl存在下，胃蛋白酶在胃中自然发现。胃蛋白酶必须稀释HCl，必须在37°C下孵育至最有效的工作。胃蛋白酶是一种蛋白水解酶，所以它基本上通过进食跨膜蛋白来打孔磷脂膜的孔。这就是为什么胃蛋白孵育后涡旋细胞是重要的原因 - 从细胞核中剪切剩余的磷脂膜和细胞质。该方法中最困难的部分是优化胃蛋白酶消化。这个必须对于每种细胞类型来完成。微妙的单细胞如淋巴细胞需要较低的胃蛋白酶浓度和更短的温育时间比从实体瘤细胞。Underdigestion不会让所有细胞质的剥离。过量酶切会开始降低核膜的可行性。以后的优化过程如下。到测试优化的最好方法是用PI染色观察核的状态后，以查看在荧光显微镜下的细胞。第三步骤中，在所有的方法中的一个共同的，是孵育相对浓缩（2N）HCl中。此步骤是非常重要的，因为它离解的DNA，使与抗体和相对大的荧光染料可访问的PJ内置模拟。使用用洗涤剂如吐温20或Triton-X缓冲液使一切访问。

贡献：弗吉尼亚州Snell.

参考文献：

White, r.a.， A. Pollack, and N.H.A Terry(1994)用氯脱氧尿苷连续标记非整倍体肿瘤和相关二倍体细胞的同时细胞因子测量。血细胞计数15:311 - 319。

白色，R.A.和N.H.A Terry（1992）一种评价使用单克隆抗体对溴酰基脲酰胺获得的双抗体流式细胞术数据的定量方法。Cytometry 13：490-495。

Terry，N.H.A，R.A.白色，M.L.Meistrich和D.P.Calkins（1991）使用培养细胞测定群体潜在倍数的流式细胞术方法的评价。细胞计数12：234-241。

Terry, n.h.a.， R.A. White, M.L. Meistrich () Cell Kinetics: from Titriated Thymidine to Flow Cytometry BJR Suppl 24:153-157。

Terry, n.h.(1995)肿瘤细胞动力学参数在放射治疗中的预测价值:关于数据生产和分析的考虑。临床肿瘤学杂志13期1833-1836。

J.C. Carlton, N.H.A. Terry和R.A. White(1991)使用流式细胞术测量小鼠肿瘤潜在倍增次数。血细胞计数12:645 - 650。

Pollack，N.H.A.Terry，C.S. Wu，B.M.聪明，r.a.白色和m.l.Meistrich（1995）在体内标记的肿瘤中碘氧氧基氨基的特异性染色：细胞动力学分析。细胞测定法20：53-61。

1. 将细胞用Brdutp（Sigma，St Louis，Mo，USA）以10μm的浓度标记60μm（时间可以根据细胞类型和培养条件而变化。）。
2. 用冷HBSS洗涤细胞一次。
3. 将细胞沉淀重悬于2ml冷HBSS中，细胞悬浮液转移至60×15mm的聚苯乙烯培养皿（康宁NY，USA）。然后将菜肴直接置于FoTodyne UV 300分析DNA发烧器的玻璃表面上，含有四个15-W灯泡（Fotodyne，Inc.，New Berlin，Wi，USA），在300nm波长下提供最大照明。细胞暴露于紫外光5分钟。
4. 然后将细胞离心，固定在70％的冰冷的甲醇和贮存在4℃下最多四个天。
5. 将细胞在PBS中洗涤两次再水合。
6. 细胞颗粒（约1 x 10^6.）被呈印迹以尽可能地除去所有无关紧要的上清液。将颗粒重悬于50μl的TDT反应缓冲液中含有：10μl5x缓冲溶液（1M钾的钾; 125mM Tris-HCl，pH 6.6; 1.26mg / ml牛血清白蛋白（BSA）;5μl25mm加入氯化钴;0.5μL（12.5个单位）的TDT（来自Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，美国）和0.25摩尔的Brdutp（Sigma）的TDT。
7. 将细胞在37℃温育60分钟。通过在15mM EDTA-NaOH，pH 7.8中洗涤细胞两次，通过两次洗涤反应。
8. 然后细胞被孵育在100µL的溶液中，该溶液包含0.7µg fitc标记的抗brdurd单克隆抗体(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA, clone B44)， 0.1% Triton-X-100 (Sigma)和1% BSA。用上述缓冲液(减去单克隆抗体)清洗细胞两次。
9. 用5µg/mL PI在RNase存在下进行反染色(Li等等。，1995年，细胞测定法20：172）。

参考文献Li, X, Troganos, F.， Melamed, M.R, and Darzynkiewicz, Z.(1994)通过光解诱导的链断裂标记检测5-溴-2-脱氧尿苷(SBIP)。Int。j .杂志。4:1157 - 1161。

1. 培养条件和设备:
   
   • 用铝箔包裹的250毫升培养瓶
   • 25 mL Iscoves Medium
   • 10 mm Brdur.
   • 将1e7 ficoll分离的细胞在37℃下培养30分钟
     
2. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
3. 用2ml冰冷的70％乙醇固定颗粒。在4°C存储长达一个月。
4. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
5. 加入2ml乙醇，pH_ TB, 4°C, 30分钟。
6. 加2ml PBTB。
7. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
8. 加入2ml PBS (pH 7.2)。
9. 在10°C下以200 xg离心10分钟。去除上清液。
10. 加入250ml PBS (pH 7.2) + 20mg /mL碘化丙啶。
11. 通过FACScan检测细胞的BrdUr/DNA含量。

供稿人：汉斯 - 迪特尔·克莱恩博士

1. Ficoll骨髓根据以前的协议。
2. 调整细胞浓度为5 × 10^4.PBS中的细胞/μL。
3. 使用50μL该细胞悬浮液用于以下步骤或将所有提到的量乘以适当的数量。
4. 用抗体对表面抗原的冰孵育30分钟：同种型对照制备与正常免疫蛋白型相同的方式。
5. 用2毫升PBS洗两次。
6. 用1ml PBS重新悬浮颗粒，轻轻旋涡。
7. 在PBS中加入1 mL 2%冰冷多聚甲醛，同时漩涡样品(最终浓度1%)。冰中孵育1小时。用PBS洗两次。
8. 将颗粒重悬于1.9ml的0.9％甘盐水溶液中的颗粒。在冰上孵育30分钟，然后在正常盐水中加入0.1ml Tween-20 10％，涡旋轻轻。
9. 加入Hoechst 33343原液60µL(生理盐水100µg/mL)。在冰箱中孵育过夜。
10. 读早上流动的样品。

g的cv_0./G₁当荧光铬球的CV小于4%时，峰值应小于5%。分散和染色特性与新鲜染色的样品不应有显著差异。

根据先前的方案1的Ficoll骨髓。
2.在PBS中调整细胞浓度至5 × 104 cells/µL。
3.使用50μL该细胞悬浮液用于以下步骤或将所有提到的量乘以适当的数量。
4.孵化30分钟的冰与表面抗原的抗体：同种型对照制备与正常免疫蛋白型相同的方式。
5.用2毫升PBS洗两次。
6.用1ml PBS重新悬浮颗粒，轻轻旋涡。
7.在PBS中加入1 mL 2%冰冷多聚甲醛，同时漩涡样品(最终浓度1%)。冰中孵育1小时。用PBS洗涤两次。
8.用1.9 mL PBS重新悬浮颗粒。加入0.1 mL 10% Tween-20于生理盐水中，轻轻搅动。在冰上孵育15分钟。
9.在PBS中洗两次。
10.在50-90µL细胞悬液中加入10 uL的bcl-2 FITC (DAKO)抗体，冰上孵育15分钟。在相应的试管中加入10µL的同型对照。
11.在生理盐水中洗涤两次，重新悬浮在1.9ml的生理盐水中。
12.在冰上孵育30分钟。
13.在正常盐水中加入0.1mL Tween-20 10％，涡旋轻轻。加入Hoechst 33343原液60µL(生理盐水100µg/mL)。在冰箱中孵育过夜，并在早晨运行样品。

1. 用非固定裂解溶液莱斯整个骨髓。摇滚5-10分钟。
2. 旋转（1500 rpm / 5分钟）。请注意：如果颗粒中有红细胞，您可能需要再次添加裂解溶液1分钟。
3. 用温培养基洗涤细胞（RPMI 1640 + 1 mm HEPES，+ 2％FCS + PEN / STREP）。
4. 计算单元格数。
5. 在2.5 x 10的媒体中制作细胞悬浮液^6.细胞/毫升。
6. 该细胞悬浮液为以下管的等分试样1毫升：
   
   ＃1）IgG1-FITC / IGG1-PE / IgG1-TC
   
   ＃2）IgG1-FITC / IGG1-PE / IgG1 + IgG2A-GAM-TC
   
   #3) IgG1-FITC/ IgG1-PE/ lineage - gamma - tc
   
   ＃4）CD45-FITC / IGG1-PE / IgG1 + IgG2A-GAM-TC
   
   #5) IgG1- fitc / CD38-PE/ IgG1+ igg2a - gamma - tc
   
   置于冰上这些管子染色赔偿。
   
   
7. 将4ml细胞悬浮液等分为下列管：
   
   X4＃6（A，B，C，D）CD34-FITC / CD38-PE / LINEAGE-GAM-TC
   
   X3＃7（A，B，C）CD34-FITC / CD95-PE / LINEAGE-GAM-TC
   
   X1 #8) (IgG1/4E3)/ CD34-PE/ lineage - gamma - tc
   
   X1＃9）（IgG1 / 4E3）/ CD34-PE / CD38-TC
   
   加入Hoechst染料，每4 mL加入20µL。37℃黑暗中孵育90分钟。
   
   
8. 从步骤5和6.用冷缓冲液（HBSS + 1mm Hepes + 2％FCS + PEN / STREP）洗涤1倍。
9. 将颗粒重悬于100μl冷洗涤溶液中。将管子＃1和9放在冰上。将51μl谱系鸡尾酒加入适当的管：
   
   血统鸡尾酒是由以下抗体组成：
   
   CD61 CALTAG 1 UL每次测试CD56 CALTAG5μL
   
   CD16 CALTAG 1 UL CD33 BD5μL
   
   CD10 CALTAG 1 UL CD66B IMMUNOTECH5μL
   
   CD19 CALTAG 2 UL CD4免疫辐压10μL
   
   CD11B CALTAG 2 UL CD8免疫电解5μL
   
   CD41 Caltag 2 uL CD22 Immunotech 5µL
   
   CD13 CALTAG 2 UL GLYA DAKO5μL
   
   对照试管中分别加入来自Caltag的纯IgG1和IgG2a各3µL。
   
   
10. 在冰上孵育细胞15-30分钟。用2-3mL冷缓冲液洗涤1x。将颗粒重悬于100μl冷缓冲液中。每管加入10μlGam-Tc。在冰上孵育15-30分钟。将2μlGAM-TC加入补偿管。用2-3mL冷缓冲液洗涤1x。
11. 将颗粒重悬于80μl冷缓冲液中。加入20μl鼠标血清。在冰上孵育15分钟。小鼠血清阻断了GAM上的任何游离受体位点，并且在GAM之后用其他小鼠抗人抗体染色时是必要的。用2-3mL冷缓冲液洗涤细胞1x。
12. 再悬浮颗粒100µL。向第8和9号试管中加入100µL的额外缓冲液。将这些试管分裂成两个额外的试管(A和B)。将5µL IgG1-FITC加入到试管A和5µL 4E3-FITC (Signet)到试管B。加入适当的其他直接结合抗体。孵育15-30分钟，用2-3毫升冷缓冲液洗1次。
    
    斯普利特管：
    
    ＃8A）的IgG1-FITC / CD34-PE / LINEAGE-GAM-TC
    
    ＃8B）4E3-FITC / CD34-PE / Lineage-GAM-TC
    
    # 9) IgG1-FITC / CD34-PE / CD38-TC
    
    # 9b) 4e3-fitc / cd34-pe / cd38-tc
    
    
13. 将颗粒重悬于4mL冷缓冲液中。在4°C存储直至排序。

点击红色加下面的迹象，查看标准作业程序为每个项目。

遵循用于细胞周期分析的相同的协议。人口的细胞凋亡将有活细胞的RNA相同的内容，但将有一个子-G_0./G₁DNA含量。

遵循相同用于细胞的细胞周期分析。细胞的凋亡群将具有子g_0./G₁DNA直方图的DNA含量。

细胞凋亡试剂盒(Nexins Research B.V， #A700)乐动体育LDsports中国

该方案是通过附睾V-FITC结合同时检测表面标志物和磷脂酰丝氨酸曝光。

1. 此步骤仅用于患者样本，培养细胞不需要。用不固定的溶解液按程序溶解外周血或骨髓。
2. 此步骤仅用于患者样本，培养细胞不需要。将细胞置于15 mL 0.9%生理盐水中(含5 mM EDTA (pH 7.4))冰上孵育15分钟。这将释放任何与PS结合的内源性Annexin V，以及释放导致假阳性的结合血小板。用冷PBS洗一次一次。
3. 将细胞分配到适当标记的管中，根据适当的协议对PE和/或PERCP或TRI标记的表面标记进行染色。
4. 用冷PBS洗一次一次。印迹颗粒非常良好地除去上清液，以免破坏待加入结合缓冲液的钙浓度。
5. 将200μl结合缓冲液加入颗粒（约10^5.－10^6.总细胞）。加入2μL膜蛋白V-FITC并在冰上孵育10分钟。保持管蛋白的管，并使用细胞的自发荧光作为流量的阴性对照。直接阅读样品。
6. 可选的：以5μg/ ml的终浓度为附睾/结合缓冲溶液添加碘化钛（股票：100μg/ ml）。在冰上孵育10分钟并直接读取流动。

特别注意事项：
只有新鲜样品用于自发细胞凋亡，无过夜储存或使用冷冻细胞。不要固定或透化细胞，因为这将导致由于在细胞膜内部瓣叶上的PS暴露而导致的假阳性。在膜蛋白V染色期间使用结合缓冲液至关重要，因为膜蛋白需要钙的生理浓度以结合。或者，可以使用细胞培养基或HEPES缓冲液，因为它们含有与结合缓冲液相同的钙水平。不要使用超过四周的绑定缓冲区，因为它可能导致假阳性结果，可能是由于pH问题。期望使用碘化丙啶来区分来自凋亡细胞的坏死细胞（假阳性）。

贡献：Oliver Kliche博士/弗吉尼亚州Snell

参考：

Fadok VA, Voelker DR, Campbell PAS, Cohen JJ, Bratton DL and Henson PM(1992)凋亡淋巴细胞表面磷酸化丝氨酸引发巨噬细胞特异性识别和清除。中国免疫科学(英文版)148,2207-2216。

1. 可选的：对于表面标志物染色，具有所需表面标记的染色细胞和适当的同种型对照30分钟的冰上。用PBS洗一次。
2. 固定：将一个部分2x PBS与一个部分2％甲醚混合（甲醇）。在轻轻涡旋的同时缓慢加入1％多聚甲醛至细胞。在4℃下孵育至少一小时。如果使用PE-CY5串联缀合物作为表面标记，则如果细胞保留在1％多聚甲醛直至TUNEL程序中，则达到最佳结果。
3. 用4mL PBS洗2次。
4. 透：如果没有完成表面标记染色，请用冰冷的70％乙醇固定细胞，同时轻轻涡旋。可以在-20℃下在70％乙醇中储存细胞两周或更长时间。如果使用表面标记，则通过用Triton-X透露细胞膜来实现最佳结果。在PBS中重悬于0.1％Triton-X的颗粒500μl，并轻轻地涡旋。在冰上孵育15分钟。用4毫升冷PBS洗两次。
5. 计算样品的数量。为至少一个超过实际样本的数量进行足够的缓冲区。加入适量的生物素-16-DUTP和TDT酶以缓冲液（所有遵循的配方）。将40μl反应缓冲液加入细胞中。对照反应是缓冲液加上没有TDT酶的生物素-16-DUTP。将管在37℃下孵育一小时。用4mL PBS洗涤细胞两次。
6. 制备足够的抗生物素蛋白混合物，比实际样品数量更少（配方遵循）。加入100μl抗杀虫混合物。在黑暗中在室温下孵育30分钟。用4ml PBS洗涤两次。
7. 用PBS重悬细胞，用于流式细胞术检测。
8. 可选：用于细胞循环分析，将碘化物升至终浓度为5μg/ mL。在室温下在黑暗中孵育30分钟。在流式细胞仪上阅读。

   TUNEL缓冲

   • 20μL5X缓冲
   • 10μl10xcocl
   • 70μldh.₂O.

   TUNEL缓冲反应混合物

   TDT反应混合

   • 40μLTUNEL缓冲
   • 0.6μL生物素-16-dUTP的
   • 每个单独样品0.3μlTDT酶

   控制反应混合物

   使新鲜。

   • 40μLTUNEL缓冲
   • 0.6μL生物素-16-dUTP的
   • 每个样品100µL缓冲液

   逃亡者

   抗生物素蛋白缓冲

   过滤并储存在4°C。

   • 4x SSC.
   • 1％BSA（W / V）
   • 添加列表项

   逃生素混合

   使新鲜。

   • 100 uL亲和素缓冲液
   • 1 ul vidin fitc（Becton dickinson）
   • 每个单独样品0.5％Triton-x 100
   注意:5x缓冲液，10x COCl，TDT酶和生物素-16-DUTP来自Boehringer Mannheim。

1. 可选，表面染色:使用利用PE和/或TRI / PERCP色单克隆抗体标准表面染色协议染色细胞。
2. 固定细胞，用2mL的1％多聚甲醛的PBS（pH 7.4）中15分钟，在4℃下。用PBS洗两次。可以储存在4℃。
3. 离心机样品。再水化沉淀在PBS中。离心机。去除上清液，吸干颗粒。
4. 细胞重悬在50µL的卡可迪酸缓冲液中，该缓冲液含有0.2 M卡可迪酸钾，2.5 mM Tris-HCl (pH 6.6)， 2.5 mM CoCl₂0.25 mg/ml BSA, 7单位Tdt, 0.5µM biotin-16-dUTP。细胞在37℃孵育1小时。用PBS洗两次。去除上清液，吸干颗粒。对照管重悬在没有Tdt酶的缓冲液中。
5. 将颗粒重悬于100μl缓冲液中，由4×SSC制成，0.1％Triton X-100,1％BSA和2.5μg/ mL抗生物素蛋白FITC。在黑暗的室温下孵育30分钟。用0.1％Triton X-100的PBS洗涤细胞两次。
6. 可选，用于DNA：重悬于500μLPBS中的细胞。加入100μlHoechst33342种库存（在PBS + 10％吐温20中为10μg/ ml），导致终浓度为0.5μg/ ml。在4℃下孵育8小时。

TUNEL技术仍然是细胞内凋亡的凋亡的黄金标准，尽管检测到较早期的细胞凋亡阶段的新方法可用。这种方法直接相当于Tunel技术，除了Brdutp代替Biotin-DUTP的事实。Brdutp比生物素-UTP昂贵几乎三个数量级，实际上几乎是比生物素-UTP强度更亮的原点。

1. 在所需的治疗或培养条件下，在汉克的缓冲盐水溶液（HBSS）中沉淀并固定在1％甲醇 - 无甲醛（Polysciences，Inc.，Warrington，Pa，USA）中，在冰上15分钟。将细胞离心并用HBSS洗涤一次。
2. 然后将细胞沉淀用冰冷的70％乙醇后固定，并在-20℃下储存长达4天。
3. 将细胞在PBS中洗涤两次再水合。
4. 细胞颗粒（约1 x 10^6.）被涂抹以尽可能地除去所有无关紧要的超值。将颗粒重悬于50μl的TDT反应缓冲液中含有：10μl5x缓冲溶液（1M钾的缓冲液; 125mM Tris-HCl，pH6.6; 1.26mg / ml牛血清白蛋白（BSA）;5μl25mm钴加入氯化物; 0.5ul（12.5个单位）的TDT（来自Boehringer Mannheim，印第安纳波利斯，美国）和0.25摩尔的Brdutp（Sigma）的TDT。
5. 将细胞在37℃温育60分钟。通过在15mm EDTA-NaOH，pH 7.8中洗涤细胞两次，通过洗涤细胞来停止反应。
6. 然后细胞被孵育在100µL的溶液中，该溶液包含0.7µg fitc标记的抗brdurd单克隆抗体(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA, clone B44)， 0.1% Triton-X-100 (Sigma)和1% BSA。用上述缓冲液(减去单克隆抗体)清洗细胞两次。
7. 如上所述，细胞在RNA酶存在下用5μg/ ml pi染色（Li等等。，1995年，细胞测定法20：172）。

不同DNA链断裂标记方法的流式细胞术检测凋亡细胞。DNA含量的双变量分布(等长等高线图)与DNA链断裂标记代表指数增长的HL-60细胞与0.15µM喜树碱共孵育3H，优先诱导细胞凋亡(Ap)的细胞进展通过S期(Del Bino)等等。，1991年）。左三面板代表DNA链的间接标记，利用BRDUTP，DUTPGENIN缀合的DUTP（D-DUTP）或生物素化的DUTP（B-DUTP）。两个右侧面板显示在直接的单步DNA链中断裂标记后的细胞分布，其中Bdipy或Fitc共轭杜氏抑制。注意纵坐标的指数比例。正如明显的，在用Brdutp与Brdutp中断的DNA链破裂标记之后，实现了来自非凋亡细胞的凋亡的最大分离。

参考：用Brdutp标记DNA链断膜。检测细胞凋亡和细胞增殖。（1995）X. Li和Z Darzynkiewicz。细胞增殖28：571-579。

在幻灯片上的Tunel测定（apoptag.®加套件[1cm x 1.5 cm面积]）

固定

1. 使用Bd裂解溶液在4℃下固定细胞10分钟（1.5％甲醛）。
2. 在PBS中洗涤细胞1x，干燥，在-20℃下冻结。
3. 在室温下解冻幻灯片。
4. 固定在3：1甲醇的混合物中：乙酸5分钟。
5. 添加约40微升平衡缓冲液（使用盖玻片）。孵育至少30分钟。
6. 应用工作强度的TdT（反应缓冲液的19μL和TDT的μL8酶，涡旋的混合物以及在微量离心管）。37温育载玻片℃下1小时。
7. 用PBS 3次冲洗玻片，每次5分钟。

检测

1. 加入工作强度抗体溶液(19µL阻断液和16µL抗地高辛荧光素的混合物)。在微离心管中漩涡良好)。在黑暗中孵育玻片一小时。
2. 用PBS洗3倍。
3. DAPI复染(取1µL/50 mL原液，加入H₂O)，将玻片盖上，静置1-2分钟。
4. 用自来水洗涤滑动并用空气擦干。
5. 在每张幻灯片上滴一滴防褪色剂(Vectashield)并覆盖它们。
6. 使用60倍镜头检查显微镜下的幻灯片。

贡献：凯瑟琳娜Clodi博士

描述

PhiPhiLux为含有两个罗丹明其成为在所述底物的裂解荧光Caspase-3的七肽底物。发射最大当用488纳米激光激发= 530纳米（FL1）。

试剂

• Phiphi Lux Reagent（Oncoimmunin，Inc。，大学公园，MD）
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
• 碘化丙烯酸铅

过程

1. 转移3-5 x 10^5.细胞到FACS管。
2. 用PBS洗涤两次的洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于残余PBS中。
3. 加入5μLPhiphiLux试剂，并在37℃下孵育1小时。
4. 用冷PBS洗涤。
5. 将细胞重悬于0.5 ml冷PBS中，并加入1µl 2 mg/ml碘化丙啶进行活细胞门控。
6. 流量分析:在Fl1上测量PhiPhi Lux荧光。有caspase-3活性的细胞比没有活性的细胞有明显更高的Fl1荧光。

贡献：伊琳娜斯蒂努夫和道格拉斯威德纳

试剂

• CMX-ROS（美图跟踪红，分子探针，Eugene，OR）
• DMSO溶液
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

CMX-ROS试剂制备

将试剂在50μg等分试样中供应作为冻干粉末。通过将94μLDMSO加入冻干粉末并储存在-20℃下，制备1毫米的原料。在染色之前，将该股票稀释至30nm的浓度为30nm，在染色之前将其温热至37℃。

过程

1. 转移3-5 x 10^5.细胞到FACS管。
2. 用PBS洗两次细胞，用剩余的PBS重悬细胞颗粒。
3. 在37°C下加入300-500μl30nm cmx-ros / rpmi。
4. 在37℃下孵育细胞1小时。
5. 用冷PBS洗涤颗粒细胞。
6. 最终细胞颗粒中加入500µl PBS，冰敷至流动分析。
7. 流量分析:测量FL3上的CMX-ROS荧光（EM MAX = 599 nm）。具有线粒体膜电位破坏的细胞显示为具有降低的FL3荧光的明显峰。

贡献：伊琳娜斯蒂努夫和道格拉斯威德纳

参考:MACHO.等等。， Cytometry 25 (1996)， 333

在存在高线粒体膜电位的情况下，JC-1形成所谓的“j聚集体”，其Fl发射最大值为590 nm (Fl 2)。当线粒体膜电位被破坏时，如细胞凋亡过程中发生的那样，JC-1变成单体，单体的发射最大值为525 nm (Fl 1)，因此，荧光由红色变为绿色表明线粒体膜电位丧失。

试剂

• JC-1（分子探针，尤金或）
• DMSO溶液
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

JC-1试剂制剂

试剂以5毫克单位的固体形式供应。通过向固体JC-1中加入1ml DMSO制备5mg /ml的库存，并在-20℃下存储。染色前，用预温至37℃的PBS将培养液稀释至5 g/ml的工作浓度。(5毫克/毫升= 7.7毫米)

过程

1. 转移3-5 x 10^5.细胞到FACS管。
2. 用PBS洗两次细胞，用剩余的PBS重悬细胞颗粒。
3. 加入300-500μl5μg/ ml JC-1。
4. 孵育细胞，在37℃10分钟。
5. 用冷PBS洗涤颗粒细胞。
6. 最终细胞颗粒中加入500µl PBS，冰敷至流动分析。
7. 流量分析:测量FL1和FL2荧光。当绘制FL1 VS FL2时，具有线粒体膜电位的破坏的细胞显示为明显的绿色偏移群体。

贡献：Douglas Weidner.

参考:Salvioli.等等。，Febs Lett 411（1997）77-82

点击红色加下面的迹象，查看标准作业程序为每个项目。

试剂和抗体

• 美国公共电视台
• 100％的甲醇
• 多甲甲醛
• Lysolithin（L-α溶血磷脂酰胆碱）（西格玛＃L-4129）
• nonidet（np40）（sigma＃n3516）
• RNAse(沃辛顿生化公司# LFO-5679)
• 牛血清白蛋白(BSA)分数V (Sigma)
• 碘化丙啶(Sigma # P-4170)
• 抗PCNA（Boehringer Mannheim生物化学＃1170406）
• 山羊抗小鼠FITC (gamfitc) (Becton Dickinson #9031)
• msigg1同种型控制（100次测试）（Coulter＃6602872）
• 多甲甲醛 - 溶血素溶液（制作新鲜）：
  • 20 - 40µg / mL溶血卵磷脂
  • PBS中不含Ca和Mg的1%多聚甲醛

过程

1. Pellet 1 x 10^6.细胞洗2次在冷PBS中。使用1.5mL的聚丙烯Eppendorf管中。
2. 将颗粒在1ml多聚甲醛 - 溶血蛋白溶液中孵育2分钟。
3. 降速（4000rpm下1.5分钟），吸出上清液，并轻轻地涡旋，以防止破碎细胞。
4. 用1ml 100%冰冷的甲醇在冰上孵育颗粒5分钟。
5. 降速，吸上清和漩涡。
6. 将颗粒放入1mL 0.1%的NP40中，置于不含Ca和Mg的PBS中，冰上孵育5分钟。
7. 降速，吸上清和漩涡。
8. 用1µg(1µL)的抗pcna单克隆抗体，用100µL含0.1% BSA的PBS稀释后，在室温下孵育细胞30-60分钟。采用相同浓度的IgG1(195µL PBS中5µL IgG1)作为同型对照。
9. 向下旋转，吸出上清，轻轻旋转。
10. 用0.5mL PBS洗涤0.1％BSA。
11. 加入1000个单位（10μl）RNase和0.5ml碘化丙锭（PBS中50μg/ ml）。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA
• nonidet（np40）
• 70％的甲醇
• 多甲甲醛
• 核糖核酸酶
• π

抗体

• MsIgG1同型控制，未共轭(Coulter #6602872)
• ki-67 unconcated（达科#m722）
• 山羊抗小鼠FITC (gamfitc) (Becton Dickinson #9031)

过程

1. 颗粒10.^6.细胞，加入1ml多聚甲醛(1% PBS)，室温孵育5分钟。自旋。
2. 加入1ml 70％冰冷甲醇，在-20℃下孵育5分钟。自旋。
3. 加入1ml NP40（0.1％在PBS中），在冰上孵育5分钟。旋转，用PBS洗涤两次。
4. 用50μLPBS稀释5μl的Ki-67单克隆抗体孵育细胞，在冰上60分钟。
5. 加入以90µL PBS/BSA(1%)稀释的10µL γ - fitc，冰置30分钟。用PBS洗两次。
6. 加入碘化丙啶(50µg/mL) 500µL + RNAse (1000 U/mL)，孵育1小时或过夜。
7. 读流。

试剂

• 3.54克NA.₂HPO._4.在100mL DDW（缓冲液为0.2M）
• 1.37克₂阿宝_4.在100mL DDW（缓冲液为0.1M）
• 赖氨酸股票解决方案：
  • 1.862 g赖氨酸盐酸盐溶于50 mL 0.2M Na₂HPO._4.
  • 将pH调整为7.4，0.1M NAH₂阿宝_4.
  • 用DDW配制总容积为100毫升
  • 储存于4℃下
• 万甲醛股票解决方案：
  • 9毫升Na₂HPO._4.， 19 mL₂阿宝_4.，22毫升DDW，4g万全甲醛
  • 加热至60°C，加入2N NaOH直到溶液变清
  • 调整pH值至7.4
  • 储存于4℃下
• Sodium-meta-periodate(σ)

抗体

• IgG1 FITC (Becton Dickinson)
• ki-67 fitc（dako＃f788）
• 任何针对表面表位的pe标记单克隆抗体

过程

1. 制备PLP试剂：7.5毫升赖氨酸储备溶液+ 2.5ml万甲醛股票+ 21.4毫克钠 - 荟牙。这项工作解决方案七天内容。
2. 孵化10.^6.细胞用PE标记的表面标记物（见免疫表协议）。用PBS洗两次。
3. 向细胞沉淀中加入1ml的PLP试剂，并在冰上孵育15分钟。
4. 向下旋转细胞，用PBS洗两次。
5. 加入10μLKI-67 FITC，用40μLPBS/ BSA（1％）稀释。准备同种型控制。在冰上孵育30分钟。用冷PBS洗涤两次。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA
• nonidet（np40）
• 70％的甲醇
• 多甲甲醛
• 核糖核酸酶
• 碘化丙烯酸铅

抗体

• MsIgG1 un共轭(Coulter #6602872)
• P120单克隆抗体（Coulter）上
• 山羊抗小鼠FITC (gamfitc) (Becton Dickinson)

过程

1. 颗粒10.^6.细胞，加入1ml多聚甲醛(1% PBS)，室温孵育5分钟。自旋。
2. 加入1毫升冰冷的70％甲醇，孵化5分钟在-20℃下。自旋。
3. 加入1ml NP40（0.1％在PBS中），在冰上孵育5分钟。旋转，用PBS洗涤两次。
4. 用2μlP120单克隆抗体孵育细胞，用50μlPBS稀释，在冰上60分钟。用PBS洗两次。
5. 在冰上加入10μL稀释的10μlGab_fitc，溶于90μLPBS/ BSA（1％）30分钟。用PBS洗两次。
6. 加入碘化丙啶(50µg/mL) 500µL + RNAse (1000 U/mL)，孵育1小时或过夜。

点击红色加下面的迹象，查看标准作业程序为每个项目。

1. Ficoll骨髓根据以前的协议。
2. 调整细胞浓度为5 × 10^4.PBS中的细胞/ UL。
3. 使用50μL该细胞悬浮液用于以下步骤，或者将所有提到的数量乘以适当的数量。
4. 与表面抗原的抗体在冰上孵育30分钟:同型对照的制备方法与正常免疫表型相同。
5. 用2毫升PBS洗两次。
6. 用1ml PBS重新悬浮颗粒，轻轻旋涡。
7. 在涡旋样品（最终浓度1％）时加入1ml 2％的2％2％冰冷的多聚甲醛。冰中孵育1小时。用PBS洗两次。
8. 用1.9 mL PBS重新悬浮颗粒。加入0.1 mL 10% Tween-20于生理盐水中，轻轻搅动。在冰上孵育15分钟。
9. 在PBS中洗两次。
10. 在冰上添加bcl-2的FITC（DAKO）的抗体的10μL细胞悬浮，并孵育50-90μL15分钟。在相应的试管中加入10µL的同型对照。
11. 在正常盐水中洗涤两次，重新悬浮在1.9ml的正常盐水中。
12. 在冰上孵育30分钟。
13. 在生理盐水中加入0.1 mL 10%的Tween-20，轻轻搅动。加入Hoechst 33343原液60µL(生理盐水100µg/mL)。在冰箱中孵育过夜，并在早晨运行样品。

1. 从1.5 x 10开始^6.白细胞在3.7-mL锥形底塑料试管中，不含上清。
2. 将细胞固定在1ml 100％冰冷甲醇中，在轻轻涡旋的同时加入细胞。继续涡旋直至颗粒崩解。
3. 将细胞在-20°C下冻结到完全10分钟。
4. 加入50μl的PBS，没有Ca，Mg，1％BSA和1％整个山羊血清。让坐在室温下30分钟。vortex偶尔。
5. 在PBS中加入50μl抗RAS抗体，在PBS中稀释1:98，1％BSA和1％整体山羊血清。在冰上孵育30分钟。
6. 用PBS洗两次，留下约50µL的上清。
7. 添加兔抗大鼠抗体的50μL的用PBS稀释1:10无钙，镁，+ 1％BSA，+ 1％的全山羊血清。涡和在冰上孵育30分钟。
8. 用1mL PBS洗涤两次，留下大约50微升的上清液。
9. 加入50μl的CapleGab-Fitc稀释1:40，用PBS，没有Ca，Mg，+ 1％BSA，+ 1％整个山羊血清。在黑暗中孵育30分钟。
10. 用1ml PBS洗两次。
11. 加入250μL高纯化的RNase。在37℃下在黑暗中孵育30分钟。
12. 将250μl碘化钛（Sigma）直接加入管中。
13. 电池可储存在4°C，直到测量。

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MDR1表达

单色

1. 1 x 10.^6.将细胞重悬于100μl的PBS中，具有2μLMRK16（Kamiya，千橡胶，Ca）（小鼠IgG2a;1.0μg总摩摩）。纯的小鼠IgG2A（Caltag）与相同的浓度用于对照（100μl细胞悬浮液中10μl抗体）。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次，用330×g离心8分钟。
2. 将细胞沉淀重悬浮于100μLPBS中与2微升生物素的山羊抗小鼠IgG2a抗体（Southern Biotech公司，伯明翰，阿拉巴马州）（1微克总的MoAb）。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次。
3. 在100µL PBS中用4µL streptavidin偶联到RED613 (Becton Dickinson, San Jose, CA)冰上重悬细胞颗粒20分钟。用冷PBS洗一次。
4. 在Becton Dickinson FACScan上通过流读取FL3上的蛋白表达(激发在488，发射在613)。

多色的

1. 1 x 10.^6.将细胞重悬于100μl的PBS中，具有2μLMRK16（Kamiya，千橡胶，Ca）（小鼠IgG2a;1.0μg总摩摩）。纯的小鼠IgG2A（Caltag）与相同的浓度用于对照（100μl细胞悬浮液中10μl抗体）。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次，用330×g离心8分钟。
2. 将细胞沉淀重悬浮于100μLPBS中与2微升生物素的山羊抗小鼠IgG2a抗体（Southern Biotech公司，伯明翰，阿拉巴马州）（1微克总的MoAb）。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次。
3. 将纯山羊血清中的细胞重悬于纯山羊血清中10分钟的非特异性结合，或用5μLIgG2A（0.5μgmoAb）的100μlPBS。洗1x冷PBS。
4. 用100µL PBS重悬细胞颗粒，用链亲和素偶联到RED613 (Becton Dickinson, San Jose, CA)和期望的PE和FITC偶联抗体。在冰上孵育20分钟。用冷PBS洗一次。
5. 通过流直接读取样本。

注:为了分析样本，MRK16表达的直方图覆盖了对照的直方图。使用Kolmogorov-Smirnov（KS）统计评估荧光的差异，表示为D，其测量两个分布函数之间的差异，并产生从-1.0到1.0的值。该方法精确地识别荧光的小差异，可用于检测低水平MDR1表达。MRK16染色强度分类如下：阴性（D <0.10），暗淡（0.10 0.25）和明亮（D> 0.25）。

参考：

• C.P.利思等等。（1995）多药耐药性（MDR1）蛋白表达与急性霉菌白血病中功能染料/药物流出的相关性，Multipameter流式细胞术语：不和谐MDR1- / Efflux +和MDR1 + / Efflux病例的鉴定。血液86（6）2329-2342。
• C.P.利思等等。（1997年），急性骨髓性白血病老年：用值得注意的是鲜明的回应标准化疗多药耐药（MDR1）和细胞遗传学具备区分生物子群的评价。血液89（9）3323-3329。

1. 重新悬浮约1 x 10^6.100μLPBS中的细胞。将5μl的IgG2A-FITC加入同种型对照管和5μL4E3-FITC以样品管。
2. 在冰上孵育15-30分钟。
3. 按时用2毫升冷PBS清洗。
4. 在200-300μL冷PBS中重悬颗粒进行FACS分析。

注:必须始终使用4E3运行同种型控制，以便Kolmogorov-Smirnov统计数据可以与MRK16一样（见上文）。D值大于0.15被认为是阳性的。可以容易地使用4E3-FITC来实现多色流动。

1. 将细胞浓度调整为1 x 10^6.细胞/mL, RPMI + 10% FCS在37°C。
2. 为起点需要500μL，并加入500μl新鲜温培养基到原来的管。
3. 在以下条件下孵育2ml以上细胞液:
   
   5µg / mL医嘱
   5µg/mL DNR + 10µg/mL维拉帕米
   10μg/ mL的维拉帕米
   
   
4. 在不同的时间点需要500μl。离心机，在冷PBS中重新悬浮颗粒。洗涤1x，将颗粒重悬于250μl冷PBS中。
5. 立即读取流。

1. 1 x 10.^6.将细胞用维拉帕米（10μg/ ml）和罗丹明-123（0.5mg / ml）预孵育在RPMI + 10％Fcs 37℃。
2. 用培养基洗涤细胞两次。
3. 在没有罗丹明-123的培养基中复苏细胞，在mdr抑制剂(如维拉帕米)存在或不存在(10µg/mL)。
4. 立即测量分值，随后每15分钟进行一次测量。

表面标记物(PE-和percp -偶联)的双重染色是可能的，并允许与某些细胞群相关。如果需要，应在染料流出前对表面标记物进行染色。

1. 在含有DIO（C2）3的10ml 37℃培养基中悬浮在终浓度为60ng / ml的培养基中。将样品在37°C waterbath中孵育30分钟。在4°C下旋转。将颗粒重悬于3毫升新鲜，温暖，无染料培养基中。将样品分成三个等分试样。将一个样品放在冰上，立即通过流动读取基线摄取。
2. 在剩余的两个等分试样中加入高达3ml的温热，无染料培养基。在最终浓度为1μg/ ml至一根管中以2.5μg/ ml，或pSC833（Sandoz Pharmaceuticals）的最终浓度加入循环孢素A（CSA，Sandoz Pharmaceuticals，Basel，Switzerland），以抑制p-糖蛋白泵。在水浴中在37℃下孵育90分钟。用培养基在4℃下洗涤细胞并将颗粒重悬于4℃培养基中。存放在冰上流动。
3. 对于多色分析，细胞可以用所需的PE-和PERCP/三偶联抗体染色，并在4°C的培养基中洗涤。

注:DioC2在波长为488nm的波长下激发，发射在500nm处，因此在Becton Dickinson FacScan上读取FL1的流动。DIOC2优于罗丹明-123（RH123），用于P-糖蛋白（P-GP）的功能分析由于更紧密的峰值，并且由于仅通过P-GP泵送的事实，而RH123被其他多药电阻泵送蛋白质。当使用蛋白质功能的单色分析时，可以在流过之前10分钟以5μg/ ml的终浓度加入样品中的碘化丙啶，以区分从活细胞中死亡。通过使用Kolmogorov-Smirnov（KS）统计学在P-GP抑制剂的存在/不存在中分析覆谱直方图的荧光荧光差异来评估Efflux。d值> 0.25用于将壳体定义为流出阳性。

参考：

• C.P.利思等等。（1995）多药耐药性（MDR1）蛋白表达与急性霉菌白血病中功能染料/药物流出的相关性，Multipameter流式细胞术语：不和谐MDR1- / Efflux +和MDR1 + / Efflux病例的鉴定。血液86（6）2329-2342。
• C.P.利思等等。（1997年），急性骨髓性白血病老年：用值得注意的是鲜明的回应标准化疗多药耐药（MDR1）和细胞遗传学具备区分生物子群的评价。血液89（9）3323-3329。

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该测定基于细胞因子作为其受体在靶细胞表面上的特定配体的原理。

试剂

• Fluorokines（直接缀合的荧光染料或生物素 - 缀合的）来自R＆d系统，包括Fluorokine洗涤溶液。
• 未标记的细胞因子阻塞实验

过程

1. 1E5细胞在体积25μL用缀合的细胞因子的10μL在冰上孵育60分钟。加入Fluorokine后摇匀。
2. 用氟因素洗涤溶液洗涤两次。（用股票溶液用PBS稀释1:10）。
3. 使用生物素化氟因素时，加入10μlStreptavidin-Pe，在冰上孵育60分钟。
4. 在步骤2中洗涤两次。

作为对照，未标记的细胞因子用于10米过量的荧光细胞因子：从相同量的细胞开始，加入未标记的细胞因子，摇动一周，孵育15分钟，加入氟，如上所述。

双重标签

荧光/生物素化细胞因子的可用性提供了与其他表面标记一起染色的可能性。双染色遵循协议Bcl-2癌蛋白。此外，可以进行与碘化丙锭的备受染色剂。

这种方法遵循表面标记染色的原则。作为一个例子，描述了与人IL-3受体的抗体标记。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA
• IL-3受体抗体(DNAX提供)
• IgG1同种型对照抗体（Coulter）
• 山羊抗小鼠FITC (gamfitc) (Becton Dickinson)

过程

1. 2E5细胞+ IL-3受体抗体，加入终浓度为5μg/ mL。在冰上孵育30分钟。
2. 用PBS洗涤两次。
3. 添加二级抗体：GAM-FITC的5μL用PBS-BSA（1％），温育在冰上30分钟45微升稀释。
4. 用PBS洗两次。

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FDG =荧光素 - 二β-半乳糖醇苷

将5mg溶于3.8 mL DDW= 2 mM FDG中。

1. 将细胞置于α - mem + 10% FCS +抗生素的培养基中，调节至10^7.细胞/毫升。
2. 取100µL细胞悬液置于facs管中，37℃水浴孵育5分钟。
3. 加入100μL2mMFDG，将持续至37℃，在37℃下再次混合并再孵育1分钟。
4. 在冰上，加入1800μL冰冷等渗培养基（α-MEM + FCS +抗生素）;在冰上孵育60分钟。

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9.1a来自冷冻骨髓的正常CD34 +细胞的分离

1. 对于袋子里的正常骨髓：
   
   将袋子放入塑料拉链袋中。进入37°C水浴和快速解冻的细胞，直到斜坡。
   
   用70%乙醇擦拭袋的端口区域，插入无菌端口适配器。
   
   用30或60毫升的注射器将细胞悬浮液从包中取出，至少使用18号针头，最好是16号针头。
   
   从注射器中移除针头并将20mL细胞悬浮液转移至50ml含有30mL温热（37℃）缓冲液的锥形管，同时轻轻旋转。立即离心。
   
   
2. 对于试管中冷冻的正常骨髓:
   
   使用4-5（5毫升）小瓶的工作。将小瓶放入塑料拉链袋中。将袋子放入37°C水浴和快速解冻的细胞，直到斜切。
   
   用70％乙醇擦拭管。
   
   将4-5小瓶的内容物转移到含有30mL温湿液的50ml锥形管，同时轻轻旋转。立即离心。
   
   
3. 小心地从管中取出上清液，因为颗粒可能没有紧密地包装。轻轻地刮管使颗粒松散。将每管灌满50毫升温缓冲液。轻轻搅动，使细胞与缓冲液充分混合。离心机。
4. 重复步骤3，但将来自两个管子的电池组合成一个。
5. 再悬浮颗粒在40毫升温缓冲液中。轻轻搅动细胞。如果有一个很好的单细胞悬液，细胞可以被涂片以去除死细胞和粒细胞。如果有可见的细胞“串”，悬浮液需要在37°C孵育，同时轻轻摇晃，然后离心。这需要重复，直到实现单细胞悬浮。
6. 在Ficoll上，将20 mL细胞悬液置于15 mL室温Ficoll上。1800转离心15-20分钟。
7. 去除Ficoll的单核细胞层。用冷缓冲液在50毫升锥形管中清洗细胞。离心机。
8. 结合所有管到一个50毫升锥形管中。填至50mL用冷的缓冲液中。除去少量样品（小于100μL）计数细胞。离心机。
9. 去除浮层。轻轻刮颗粒。基于总细胞计数，添加Miltenyi推荐的冷缓冲器量。然后添加推荐的抗体量（用于间接MAC套件的溶液A1和溶液A2）。Vortex轻轻地混合细胞和抗体良好。
10. 将细胞孵育在冰箱中15分钟。将管填充至50毫升冷缓冲液和离心机。用50mL冷缓冲液洗涤第二次。
11. 去除浮层。轻轻刮颗粒。基于总细胞计数，增加Miltenyi推荐的冷量。然后添加推荐的抗体量（用于间接MACS套件的溶液B）。Vortex轻轻地混合细胞和抗体良好。
12. 将细胞孵育在冰箱中15分钟。将管填充至50毫升冷缓冲液和离心机。
13. 去除浮层。轻轻刮颗粒。向细胞中加入足够的冷缓冲液，使最终细胞浓度约为1 × 10^8.对VS列的细胞/ ml和1x10^7.对RS列。
14. 用冷脱气缓冲液装载柱。
15. 在30μm尼龙网过滤器上过滤电池悬浮液。保留少量的细胞悬浮液并记录精确的质量保证和质量控制（QA / QC）。
16. 添加细胞悬液。按照米尔特尼的指示进行分离。如果需要更高的纯度，将正馏分放在第二柱上。
17. 保留少量最终分数并记录QA / QC的精确体积。

mac电脑的缓冲

• 汉克的平衡盐水溶液（HBSS）-Ca⁺²，-Mg⁺²
• 0.5％BSA.
• 0.6%柠檬酸葡萄糖抗凝剂-A式(ACD-A)(百特)
• 100 U /毫升肝素
• 100-200 U/mL DNAse(使用前必须直接添加)
• 过滤器消毒并储存在4°C

注:分离冷冻骨髓最重要的任务是实现单细胞悬浮。这主要是通过缓冲液中的dna酶来完成的。为了达到这个目的，你可能需要200 U/mL的dna酶在缓冲液中直到Ficoll步骤。去除单核层后，可将浓度降至100 U/mL。我通常在整个过程中使用100 U/mL。同样，如果你发现你有一个特别硬的样品，你可以增加dna酶到200 U/mL，但不能更高。在Ficoll之后，细胞保持低温是非常重要的。理想情况下，细胞在整个过程中都是冷的，以保持细胞活力，但必需的dna酶抢占了这一过程。

请参阅Miltenyi插入的公司信息。

正常CD34的9.1B分离⁺细胞来自新鲜的动员干细胞

1. 重悬样品达到100mL MACS缓冲液（见下文配方）。分装到两个50毫升锥形管中。离心在1000rpm，以“软旋转”沉淀10分钟。软自旋保持血小板，都集中pheresis样品中，在上清液中。血小板导致与样品的染色，以及样品通过磁列正在运行的主要问题。的supernantant必须被抽吸，不倒出，因为粒料是松动。
2. 如果从软自旋上清液仍相对混浊，软自旋可以被重复。
3. ACD-A改变了Pheresis样品中细胞的密度，使得粒细胞将保持在Ficoll的相互作用处。虽然Pheresis样品具有高浓度的粒细胞，但在激活之前除去血小板是更重要的。替代方案可以是样品最初悬浮在没有ACD-A的缓冲器中，然后是归良的。然后可以将单核层重悬于具有ACD-A的缓冲液中，并且进行软旋转。我们发现最好不要留下粒细胞并调节抗体的浓度（如下）。
4. 计算单元总数。将样品组合成一个50 ml锥形管。Miltenyi根据细胞总数列出抗体量;然而，这可以根据分类参数的阳性数量的估计来调整。由于Peresis有1-10％CD34⁺细胞，我们通常使用50％的推荐量的抗体。如果未进行味道，则这可以减少到抗体的量，但缓冲液不应下降，并且孵育时间应延长至30分钟。添加Miltenyi推荐的缓冲区数量。加入试剂A1的量，轻轻摇动。添加推荐的试剂A2，轻轻摇动。孵育在冰箱中15分钟，周期性地轻轻摇动样品。
5. 用50ml MAC缓冲液洗涤样品两次。
6. 将样品重新悬浮在推荐的缓冲液中，并_试剂B的量，轻轻摇动。孵育在冰箱中15分钟，周期性地轻轻摇动样品。
7. 用50ml MACS缓冲液洗涤样品一次。
8. 将样品重新悬浮在至少10毫升脱气（见注释）MAC缓冲器1 x 10中^9.总的细胞，或至多20毫升2×10^9.总细胞。在VS阳性选择栏上运行样本。
9. 用3毫升脱气缓冲液清洗2X。
10. 附加停止公鸡和注射器VS塔的底部。从磁体中删除列。反吹柱用6毫升脱气缓冲液中。在磁铁更换色谱柱。
11. 删除停止公鸡。允许缓冲区流过列。用3ml缓冲液洗涤2x。
12. 从磁体中删除列。添加6ml缓冲液的柱，并允许运行通过。添加6ml缓冲液的柱和扎列。
13. 计数从每个分数收集的细胞总数，以计算分离的恢复。
14. 在收集的级分中进行流式细胞术，以评估用CD45-FITC和CD34-PE（Becton Dickinson）的样品纯度。

mac电脑的缓冲

• 汉克的平衡盐水溶液（HBSS）-Ca⁺²，-Mg⁺²
• 0.5％BSA.
• 0.6%柠檬酸葡萄糖抗凝剂- A式(ACDA)(百特)
• 过滤器消毒并储存在4°C

注:运行仅使用脱气缓冲区的磁列时非常重要。去缓冲液，将100ml缓冲液放入150ml瓶中。将橡胶塞放在瓶子的口中附着在真空管线上。转动真空。将缓冲液在室温下脱涂至少30分钟。更换瓶盖和冷藏缓冲液直至冷。按照指示使用缓冲区。

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1. 电池在甲醇:醋酸中固定2X, 3:1，放在载玻片上。玻片的预处理对于淋巴结细胞或其他组织的制备是非常重要的。
   
   2分钟2X SSC
   5分钟triton-x / hcl
   5分钟PBS
   5分钟PBS / MGCL₂（％ml 1m mgcl₂+ 95毫升PBS）
   甲醛5分钟1％（1.35ml 37％甲醛+ 48.7ml mgcl₂/ PBS）
   5分钟PBS
   乙醇系列（70％，85％，100％）
   风干幻灯片
   
   
2. 探针鸡尾酒：7μlCEP缓冲液（想象定有焦化染色体）
   
   1μL焦化染色体7探针
   2µL 3染色体(Cy3) (Oncor)
   
   漩涡良好。在73oC下变化5分钟。
   
   
3. 用70%甲酰胺/2X SSC加热科普林瓶至37°C。变性切片3分钟。立即将玻片放入冰镇酒精系列中，每次3分钟(70%，85%，100%)。
4. 过夜杂交。
5. 洗涤3X在65％甲酰胺/ 2×SSC5分钟在37℃科普林罐内部。
   
   1x 8分钟2x SSC，37°C
   1X 5分钟4X SSC/Tween 20
   
   
6. 每个载玻片上的DAPI 1 mL占据占据占有1至2分钟。用正常的H轻轻洗净₂然后用空气吹干。
7. 添加1滴抗褪色(vectasshield)和遮盖。
   
   杂交两晚。
   
   
8. 50%甲酰胺/2X SSC在42°C的Coplin瓶内洗涤5分钟。
   
   3x 5分钟0.1x SSC在60oC时
   的非特异性在4X SSC结合阻断/ 0.2％吐温20 + 5％BSA
   1:20 00 avidin-FITC(载体抗体)
   1：200抗生物素生物素化
   
   
9. 所有抗体稀释在4X SSC /吐温20 / BSA。
   
   服用FITC 30分钟
   
   
10. 洗3X 5分钟4X SSC/Tween 20
    
    抗生物素蛋白FITC 45分钟
    
    
11. 洗3X 5分钟4X SSC/Tween 20
    
    艾凡纳 - FITC 30分钟
    
    
12. 洗3X 5分钟4X SSC/Tween 20
13. 用DAPI 1mL的对1至2分钟各滑动染液，与正常H轻轻地洗₂然后用空气吹干。
14. 添加1滴抗褪色(vectasshield)和遮盖。

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PCR条件

10μl反应中的1.0μg总RNA用于逆转录。反应的一二十二分用于PCR反应。PCR反应的总体积为25μL。生物素标记的MDR1a，B2-M底漆和标记的MDR1b，B2-M B引物的最终浓度为0.2μm，0.2μm的DNTP，2.5μl10x反应缓冲液和1.5 U.

1. 旋转离心细胞为200×g。用PBS洗两次。
2. 重悬沉淀在1.5mL PBS中。添加0.5mL的4％多聚甲醛的PBS中，同时轻轻地涡旋。孵育在4℃下15分钟。
3. 用PBS洗涤细胞两次。
4. 将4°C存储在PBS中的细胞长达一个月。

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1x）

• 0.23g nah₂阿宝_4.（无水，1.9毫米）
• 1.24 g na.₂HPO._4.（无水，8.1毫米）
• 9.25 g NaCl（154毫米）
  
  添加H₂o到900毫升
  
  如果需要，用1M NaOH或1M HCl调节至所需的pH（通常为7.2至7.4）。添加H₂o到1升。如果需要，过滤器灭菌。在4°C下无限地存储
• 175.3克氯化钠
• 88.24克柠檬酸钠
  
  加950 ml h₂O.
  
  调节pH至7用5M盐酸
  
  用h稀释1升₂O.
  
  在室温下存储<1个月

EDTA（乙二胺四乙酸）0.5M，pH 8.0的

溶解186.1g na₂-EDTA^。2h₂O在700毫升水中搅拌。用10 M NaOH调节pH至8.0，然后用H调节体积至1升₂o和高压灭菌器。在室温下储存<1年。

在pH值调整到8之前，EDTA不会完全溶解。

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抗体要求：

• IgG亚型，每个反应指定的液体（由于恢复差，不建议不建议使用小于50ug）
• 无载体-无BSA，明胶¹或其他稳定剂;叠氮化物和甘油很好
• 流式细胞术或IHC的优选认证;如果单克隆并识别出表位的本地形式，蛋白质印迹抗体可以起作用

¹我们已经成功地体验了用明胶和BSA标记抗体（确实竞争金属加载的聚合物），但这些蛋白质的存在使得不可能确定在标记反应后回收多少IgG和每种抗体的金属原子的数量。必须用已知表达表位的细胞测定标记抗体的可用性。

CyTOF的抗体标记

聚合物的镧系元素	抗体二硫键的部分减少
旋转聚合物管10s。对于每只AB，将一个小瓶聚合物溶于95μldbPCR管中的L-缓冲液。	如果任何抗体的体积为>500uL，开始在50k的旋转过滤器中浓缩;如果其中含有甘油浓缩物，用r缓冲液清洗几次。
加5μl.db镧系元素溶液至聚合物溶液，通过吸取70X（使用屏障提示）混合。
在37℃孵育> 30-40'。
***在抗体之前必须准备好镧系元素的聚合物***
等待15分钟，从抗体开始→	用100ug测定所需的R-Buffer总量为400uLdb抗体在离心装置中加入R-Buffer (50k)，加入100ug抗体，移液混合。 →离心12,000g 7'。
	丢弃滤液等待镧系元素+聚合物孵育。
聚合物孵育后
将200ul L-Buffer添加到3K旋转过滤器，将金属加载的聚合物（100UL）转移到旋滤器中。 12,000g(12 ')离心。
	制备4 mM TCEP:将8µL 0.5M TCEP溶液加入1mL R-Buffer中。
	添加100微升db取4mM TCEP至抗体，移液管20x →在37oC孵育30'。***时机至关重要
加300μl.C-缓冲液，离心12英寸去除游离金属。(如果在聚合物离心前抗体部分降低，停止离心并继续使用Ab)	加入300µL的C缓冲液至部分减少抗体，12,000g离心7 '。 （这是洗出过量的TCEP，停止抗体减少。）
在95uL中重新悬浮载镧聚合物德国联邦铁路(db) = 195C-Buffer（残留应为<5UL）（吸移管20x，允许在等待抗体时孵育过滤器。）	再用400µL洗涤C缓冲
	快速移动到下一步（组合聚合物和抗体）以防止重新氧化抗体。
聚合物缀合到抗体
移液管30X，转移镧系元素（105UL）db）添加到含有部分还原的抗体50k的过滤器。
用移液管轻轻混合，在37度孵育O.C为60 '(2小时)。
加入300μlW缓冲液和离心机。用400μLW缓冲液重复3次洗涤3次。@Centrifuge 7分钟，丢弃滤液
重悬于W-缓冲液：残余为〜15μL;加入88微升德国联邦铁路(db) = 188(纳米滴总103uL - 2uL;金属含量为1uL +999uL 2%盐酸;100 uldb在0.5ug/uL Ab稳定剂+0.05%叠氮化物中纺丝并重组)
抗体标记效率的测量
nanodrop.:测量抗体浓度(使用2ul)。(蛋白IgG)(W-Buffer空白)
ICP-MS：在2％HCl中制备10倍稀释液至10-5。分析100微升的10-5稀释。将3个最高值的平均值与标准进行比较（1 PPB）。
抗体储存：离心机抗体为10’ 。重悬抗体至0.5微克/微升在存储缓冲液或50％甘油。（注〜15ul残差。）
聚合物旋转过滤器：PALL NANOSEP 3K OMEGA CAT＃OD030C35;离心装置：Millipore Amicon Ultra 0.5 ml 50k Cat＃UFC505096;镧系元素的工作浓度为50毫米

db如果结合200ug IgG，则增加一倍量/体积。

Adrienne Halapa - 2010年11月（由Duncan Mak修改 - 2017年6月）

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• 根据需要刺激/抑制/治疗细胞（每个样品1×10 ^ 6个细胞）。
• 要停止的信号转导中，添加16％甲醛（PFA）直接向所有管（每管100μl的，1:10）。
  • 在RT温育10’ 。
  • 离心机以600g为6’ 在4℃下
  • 吸。洗涤3次用洗涤缓冲液（PBS-0.5％BSA-0.02％叠氮化钠）。
  • 该固定步骤是有问题的 - PFA可能会影响表面AB的性能。

• 注意每个样品的AB混合体积，在35-40UL染色缓冲液（0.5％BSA-PBS）中重新悬挂最多1.5M细胞，在室温下加入AB混合物（10-15UL）30'-60'。
  • 用1.5ml洗涤缓冲液洗涤2-3x。漩涡混合。

(用1:500 Rh103在PBS中染色20分钟或25uM顺铂中染色1分钟)

• 在PBS中添加300-500微升1.6％的甲醛至细胞沉淀，孵育10’ （或1小时）@ RT。
• 旋转细胞，弃上清。(无需清洗，以减少细胞损失。)
  • 将100ul的PBS滴在细胞上，旋涡使细胞颗粒破碎。
• 通过加入冷100％甲醇渗透并在4℃下孵育10'（偏好-20℃，或者使用BD Fix / Pubs Buffer或其他已知在您的实验室中工作的其他渗透方法）
  • 添加0.9毫升每1×10 ^ 6个细胞的甲醇中（最终为90％）（取决于表位的50〜90％甲醇）
  • 可选：在-20 c储存最多24小时，最多1个月IF -80 C.
• 用洗涤缓冲液洗涤2-4x。
  • BSA会的ppt除非> 1毫升的洗涤缓冲液被添加-需要大于等量的甲醇!
  • 留在不到35-40uL细胞最后一次洗涤后

• 注Ab混合体积每个样品(10-15uL)
• 将移液管转化为35-40ul，占据每个样品管中的细胞，并用染色缓冲液（例如，从填充缓冲液的96孔板），弥补设定的体积，转移到新管。（染色浓度尤其是磷蛋白的物质）。
• 添加AB混合物（10-15UL），使最终染色体积恰好50UL，在室温下孵育30'-60'。
  • 宁愿与温和摇动/搅拌/混合孵育。
• 用洗涤液洗2-3遍。
  

• 在室温下加入在PBS中稀释的0.5ml 1：1000的IR-嵌入器，在室温下至少30分钟（在4℃下优选过夜）。
  • 延长红外染色，最多至少一周，如果仪器不可用，也会工作
  • （如果不透化，染色细胞，含有1：500的IR-interpalator，在0.3％皂苷中，洗涤缓冲液，20'）在室温下）
• 用2ml洗涤缓冲液洗涤2x（计数并过滤最终洗涤，如果未进行进一步洗涤）
• For better instrument stability: wash 1x with 1mL of MilliQ water**, (count cells if starting cell number is >1M, 0.5M is ideal for a single injection of 400uL) ** Some cells stick to plastic (no matter it’s polystyrene or polypropylene) and one may lose >90% of cells in this step; use 0.1%BSA in MilliQ water instead.
• 过滤最终洗涤（通过蓝色管（35um），在残留体积（〜50ul）中留下细胞沉淀。
• 自动进样器:(在50UL中重悬细胞颗粒）;将50ul eq-珠子加入每个孔，转移细胞悬浮液到良好（96-深孔板;>注射之前将添加400ul缓冲液）。

阿德里安·哈普岛，多伦多大学 - 2012年3月，DM修改了2015年3月