标准操作程序——北校区

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试剂

• histopaque - 1077(σ# 1077 - 1)
• 磷酸缓冲盐(PBS)

过程

1. 15毫升锥形离心管,添加5.0毫升histopaque - 1077和室温。
2. 准备样品混合物中分离15毫升管:混合5毫升的血液/骨髓送气音和5毫升的PBS。
3. 小心翼翼地覆盖Histopaque血液/骨髓。离心机在400 x g 20分钟在室温下没有刹车。
4. 单核细胞层是可见的白色混浊层位于两者之间的接口的解决方案。小心翼翼地吸入接口与巴斯德吸管和转移到另一个15毫升管。
5. 填补这一管与PBS和离心机在500 x g 5分钟。
6. 吸入上层清液和丢弃。
7. Resuspend细胞颗粒为5.0毫升PBS和重复步骤5和6。
8. 摒弃上层清液,resuspend细胞颗粒1毫升的PBS。
   

试剂

• Histopaque 1119(σ# 1119 - 1)
• σHistopaque 1077 (1077 - 1)
• 磷酸缓冲盐溶液(PBS)

过程

1. 添加3毫升Histopaque 1119 15毫升锥形离心管。
2. 仔细层3毫升Histopaque 1077到Histopaque 1119。
3. 仔细层6毫升到上梯度管从步骤2。
4. 离心机在700 x g在室温下30分钟。
5. 小心翼翼地把离心管。应该观察到两个不同的不透明层。
6. 送气音和丢弃0.5厘米内液体层a细胞转移这一层管标记“单核细胞”。
7. 送气音和0.5厘米内丢弃剩余的液体层b细胞转移这一层管标记“粒细胞”。
8. 洗细胞添加10毫升PBS。在500 x g离心10分钟。将上层的挑出。
9. Resuspend细胞用巴斯德吸管温柔的愿望。
10. 重复步骤8和9。
11. Resuspend PBS的细胞在一个适当的体积和使用。
    

Non-fixing赖氨酸溶液

氯化铵溶解

10倍浓度

稀释10毫升股票90毫升蒸馏水的两倍。存储在4°C。

• NH4Cl(氯化铵)80.2 g
• NaHCO3(碳酸氢钠)8.4 g
• EDTA二钠3.7克

工作方案

QS和双重蒸馏水1升。商店股票在4°C长达六个月。

过程

1. 获得一个整体标本在10毫升肝素化管,最好无防腐剂。
2. 四整除2毫升每50毫升锥形离心管。
3. 立即用冷填充管50毫升1 x赖氨酸的解决方案。
4. 岩石在室温下10分钟。
5. 自旋在4°C g 10分钟250 x。
6. 轻轻倒出上层清液,让管排水。
7. Resuspend颗粒通过管在管架(即。,刮球)。
8. 结合两个球团成一个50毫升管。填补与冷PBS洗10毫升。
9. 自旋,轻轻倒出,刮颗粒。
10. 结合这两个球团成一个管和洗10毫升冷PBS。
11. 旋转,轻轻倒出,刮颗粒。根据需要使用细胞。

注意:这种渗透溶解方法不破坏白细胞或改变膜不对称。由于裂解的渗透方法,必须稀释10倍的股票1 x。使用一个缓冲如PBS的渗透性改变裂解缓冲,它将不再有效。这种溶解技术将离开所有白细胞的数量,包括粒细胞。

由:弗吉尼亚斯奈尔

进一步阅读:修改手册的流式细胞术方法,保罗·罗宾逊,编辑,Wiley-Liss Inc .)

共同特征的流仪研究固体组织要求从分散成单个细胞(核)在染色和分析。分散流仪结果的实体肿瘤可以通过多种方法,其中大部分采用机械和酶解集的组合。传播方法的选择取决于材料的类型检查,来衡量。同时,需要特殊处理:

血细胞计数器网格系统

错误可以在很多方面介绍:稀释错误,损失的细胞在移液过程中,不均匀悬浮的细胞,过度充盈或未充满的室和细胞计数之前解决。随机分布的细胞室是错误的另一个来源,但可以弥补通过计算大量的细胞。洁净室之前和之后使用。如果加载室太严重,清洁它,重新开始;不要试图去除多余液体。

例如:用台盼蓝细胞悬液稀释样本1:1

网格# 1(16平方)= 195个细胞
网格# 2(16平方)= 177个细胞
网格# 3(16平方)= 204个细胞
网格# 4(16平方)= 166个细胞

总= 742个细胞
意味着= 185.5细胞

公式:细胞浓度(细胞/ mL) = x(10)稀释系数
= 185.5 x (104) 2
= 3.71 x 106细胞/毫升

1. 快速解冻冷冻的短暂孵化瓶细胞管在37°C水浴直到样品只是泥泞的。擦管和70%的乙醇。
2. 样品转移到15毫升锥形管含有10 - 13毫升RPMI 1640完全培养基加热到37°C。
3. 离心细胞立即在800 x g。去除浮层。
4. 洗细胞2 x 10毫升RPMI完成。离心细胞。
5. Resuspend细胞所需的缓冲区或中等和使用。

注:DMSO极坐标平面分子,不仅是一种区分代理也有毒细胞。这种毒性是在温暖的温度。是非常重要的,因此,为了消除细胞的冷冻剂尽可能迅速。这是通过立即解冻细胞悬液稀释成大量的媒介,使离心细胞移除DMSO溶液稀释。

1. 红细胞表面溶解或聚蔗糖细胞使用无菌方法。洗细胞1 x与冷无菌培养基。
2. Resuspend细胞数量的冷媒介。细胞计数。离心样品。
3. 细胞应该冻结在10 - 20 x 106细胞的整除。500年Resuspend颗粒µL每管冷媒介。
4. 标签cryotubes用适当的信息:

细胞系:

细胞系的名字
日期
通道数量(如果已知)
的细胞来源
细胞的数量

主要的组织:

姓和初始的病人
MD安德森数量
日期
诊断
组织类型(BM、铅、Ph值)
治疗(F = ficolled L =细胞溶解)

5。添加等量的冷冻剂(配方)RPMI drop-wise而轻轻旋转。的比率RPMI细胞悬液冷冻剂应该是1:1。
6。产生的细胞悬液加1毫升到适当的crytubes。把试管放在冰。

-70°C的冷冻冰箱

1. 管一个cryobox已冷却到4°C。
2. 冰箱cryobox到-70°C。
3. 消除液态氮冷冻瓶第二天冰箱。
4. 空cryobox储存在冰箱里。
5. 在控制冰箱冻结:
   °你可能需要一个试点管作为一个学历冰箱的内部控制。500年cryovial地方µL RPMI 500µL制冷剂。搁置与准备管。
   °学历冰箱降温4°C室。
   °cryovials进室的地方。冷冻过程大约需要一个小时。
   °立即移除管液态氮冷冻。

冷冻剂

40毫升汉克的缓冲盐溶液(hbs) - Ca + 2毫克+ 2
20毫升DMSO溶液
40毫升胎牛血清
100毫升

注:DMSO极坐标平面分子,不仅是一种区分代理也有毒细胞。这种毒性是在温暖的温度。是非常重要因此,添加DMSO作为最后一步,保持细胞冷冻保存添加DMSO溶液后,尽快启动冻结过程。DMSO溶液可以保持细胞在冷冻通过阻止细胞内的水结晶和脂质膜破裂。

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评估一个表面标记的细胞周期的表情propidium碘始于染色所需的样本的标准程序所需的抗体及其同形像控制。细胞复染色前必须是固定的,和两个过程:乙醇-或paraformaldehyde-based停留。使用的方法应该是依靠被测现象的重要性。乙醇固定可以提供研究者一个优秀的简历进行DNA分析,多聚甲醛技术紧随其后的是乙醇是更好的保持表面标记荧光。

1. 基于乙醇固定:
   
   0.7毫升的冰冷的100%乙醇添加到1 x 10⁶染色细胞包含在0.3毫升冷PBS。孵化在一夜之间为30分钟或-20°C。离心机,去除浮层。
   
   或者,
   
   多聚甲醛固定:
   
   添加0.5毫升的2%多聚甲醛在PBS 1 x 10⁶染色细胞0.5毫升PBS。孵化在4°C 30分钟。离心机和洗一次冷PBS。样品可以马上复染色或储存在4°C长达一个月。
   
   
2. 增加250µL 500单位/毫升的核糖核酸酶与1.12%柠檬酸钠PBS细胞颗粒。轻轻涡和孵化37°C 30分钟。
3. 添加250µL propidium碘(σ)50毫克/毫升样品。在室温下孵化在黑暗中至少1小时。
4. 在流式细胞分析仪看样品。

1. 2 x 10⁶细胞染色有两个FITC标记的单克隆抗体,PE或PERCP。按照标准程序与表面标记染色。过程适当的同形像并行控制。
2. 修复细胞30分钟0.5%多聚甲醛在4°C(1毫升)。
3. 离心机在500 x g细胞5分钟。
4. Resuspend细胞0.1% triton - x - 100 (PBS)在室温下3分钟。
5. 离心细胞并与PBS洗两次。
6. 添加DAPI实现最终的浓度1µM;在黑暗中孵化1小时或隔夜。

试剂

• 股票的解决方案AO: 1毫克/毫升
• Phosphate-citric酸缓冲(pH值6.0)
  • 37 0.1毫升柠檬酸
  • 63毫升0.2 Na₂HPO₄
• 解决方案一
  • 0.1毫升Triton x - 100(0.1%最后)
  • 8.0毫升盐酸1 N (0.08 N最后)
  • 0.877克氯化钠(0.15 N最后)
  • QS和dH 100毫升₂o .存储6个月在4°C,在黑暗。
• 解决方案B
  • 100毫升Phosphate-Citric酸缓冲
  • 0.877克氯化钠(0.15米决赛)
  • 34毫克EDTA二钠(最后1毫米)
  • 0.6毫升股票AO(20µM)
  • 储存6个月在4°C。
  • 用于配制瓶0.4毫升解决方案和1.2毫升溶液B(铝箔包装瓶)
• 核分离培养基:
  • 10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.6)
  • 1毫米柠檬酸钠
  • 2毫米MgCl₂
  • 0.1% (v / v)非离子去污剂Nonident p 40

染色不固定的细胞

1. 转移200µL细胞悬液(最多2 x 10⁵流式细胞仪管细胞)。
2. 在冰寒冷。增加400µL解决冰轻轻和等待15秒。
3. 添加1.2毫升的冰冷的解决方案B轻轻下至分钟和测量细胞发光。

固定细胞

1. 修复细胞70%乙醇在4°C。
2. 洗细胞(250 x g, 10分钟)两次去除乙醇和resuspend在PBS 2 x 10⁶/毫升。
3. 染色200µL A和B细胞悬液使用解决方案如上所述。(Triton x - 100与固定细胞不是必需的)。

估计的特异性反应,除去乙醇和PBS resuspend细胞。孵化与核糖核酸酶(103 U /毫升)30分钟在AO着色前37°C。与样品不接受核糖核酸酶。

注1:AO浓度是至关重要的。如果手机号高(> 2 x 10⁶/毫升)绑定AO的数量比例高和自由染料可能会减少。核糖核酸变性可能是不完整的和一些RNA污渍绿色。因此,稀释细胞悬液。

注2:如果测量喷嘴外(即发生。在空气中),染料扩散流离开喷嘴后发生。这可以降低实际的AO浓度。因此,增加60µM AO浓度溶液中的B和增加流量。重要的是要确定正确的浓度和流量对个人的机器。

注3:过滤器:使用640或650 nm长通过过滤器,而不是610或620海里AO绑定到RNA(减少DNA组件)。

注4:大多数商业工具很好地工作。以下仪器需要更高的AO浓度(即。,关于25-60µM)来弥补染料扩散:流式细胞仪II,流式细胞仪II, FACStar,史诗IV和C和30-H Cytofluorograf。

注5:Ortho-50 H, non-sorting胜过排序一个频道。

采集和分析

当获取样本吖啶橙,双重歧视(DDM) FACScan必须的功能。DDM设置将FL1, AO会发出荧光绿色当绑定到DNA。AO的增益设置设置为1时的理想。这些收益很少,需要调整。获得的参数是FL1区域,FL1宽度,FL3高度线性模式和FL1高度在日志模式。这个测量五千个细胞通常是足够的。

设置机器样本时,最好使用一个控制细胞群。虽然散射特性的细胞通常不感兴趣的透化作用后,第一个参数应该调整SSC诉FSC,以确保所有的细胞都被收购,和消除不必要的收购碎片。第二个设置调整应该FL1区域诉FL1宽度。这是传统的G₀- g₁被设定在200年的峰值FL1区域。接下来,看FL1高度诉FL3高度或FL1区域诉FL3高度,设置RNA (FL3), G₀RNA水平接近左边G₂M RNA不延伸到右侧,基本上在屏幕的中心。在这一点上,样本可能被收购,应该不需要或很少调整为其他样本。如果使用多个细胞系,分别不同的线路可能需要调整。分析看到的,显示FL1诉FL1宽度。做一个门在单线态。显示FL1高度诉FL3高度,与逻辑门在G₁。让另一个门排除坏死细胞的左下亚二倍的面积FL1高度。“门规格”,变化G3 = R3 G3 = R1和R2。显示直方图FL1高度,G3的逻辑控制。你必须结合逻辑门为R1和R2和盖茨不会总和。做一个标记在直方图的亚二倍的地区。结果凋亡细胞百分比是百分比。

由:弗吉尼亚斯奈尔

进一步阅读:

Darzynkiewicz, z微分染色完整细胞的DNA和RNA,用吖啶橙孤立的细胞核。在细胞生物学方法,卷33。z Darzynkiewicz & h . Crissman eds。学术出版社,纽约,1990年。页285 - 298。

来自流式细胞术方法的手册,保罗·罗宾逊,编辑,Wiley-Liss Inc .)

这种技术旨在检测的细胞有丝分裂期的细胞是基于事实在不同细胞周期阶段并不同样敏感部分酸变性。

1. e6细胞修复500µL PBS通过添加4.5毫升冷70%乙醇在玻璃管。在这一点上,样本可以储存在4°C,以供将来使用。
2. 离心细胞,去除上层清液和resuspend 1毫升哈佛商学院。
3. 处理100µL高纯度核糖核酸酶稀释1:5000(例如,沃辛顿)。在37°C孵化45分钟。
4. 与500年混合200 -µL整除µL缓冲区包含0.1氯化钾在pH值1.4和0.1 m盐酸。
5. 添加2.0毫升的5µg /毫升吖啶橙在缓冲区包含0.1 m柠檬酸,0.2 Na₂HPO₄在pH值2.6。
6. 在流式细胞分析仪测量立即。

1. 标签与IdUr细胞或BrdUr 10µg /毫升的浓度为30分钟37°C。洗1 x与PBS 1500 rpm 5分钟。
2. Resuspend颗粒在70%乙醇轻轻涡流修复细胞。细胞储存在4°C至少24小时或一个月。
3. 分离细胞核:
   
   培养细胞5毫升0.025 - -0.01%胃蛋白酶(σ)w / v 0.01 n HCl 1小时或最佳时间37°C。
   
   涡细胞悬液为单个细胞悬浊液30秒。实体肿瘤,细胞悬液可能需要通过18-gauge针和过滤35-µm尼龙网。
   
   在2000转离心5分钟(Sorvall Technospin)。
   
   
4. Resuspend丸1毫升的2 n HCl 20分钟37°C。
5. 盐酸中和2毫升0.1四硼酸钠(使用2 x 2 n盐酸的体积)。在2000转离心5分钟。洗2 x在PBTB(2000转/ 5分钟)。
6. BrdUr染色样品:
   
   150年Resuspend 2 e6核µL BrdUr特殊抗体(Caltag)稀释1:50 0 v / v PBTB 1小时在黑暗中在室温下。(我们目前使用BR3从另一个来源(Dolbeare)在1:10的浓度稀释,用于最终的浓度1:50 0,所以使用稀释股票1:50)。
   
   洗2 x PBTB(2000转/ 5分钟)。
   
   Resuspend颗粒在150年µL GAM-FITC免疫球蛋白(σ)稀释1:50 v / v PBTB和孵化1小时在黑暗中在室温下。
   
   洗2 x PBTB(2000转/ 5分钟)。
   
   
7. IdUr染色样品:
   
   Resuspend 2 e6原子核在20µL IdUr / BrdUr特定B44-FITC抗体(Becton Dickinson)稀释1:2 v / v PBTB和孵化1小时在黑暗中在室温下。
   
   洗2 x PBTB(2000转/ 5分钟)。
   
   
8. 10µg Resuspend核/毫升π2毫升PBTB。存储核悬浮在4°C至少一个小时,最好是在一夜之间。
9. 添加核糖核酸酶前30分钟(37°C)流在最后10µg /毫升的浓度。

笔记
显然,因为这个过程中使用胃蛋白酶片从细胞核,细胞质中有必要尽可能均匀的一个细胞群细胞身份将丢失。还有其他的方法,不使用胃蛋白酶消化,但这种方法给最好的简历在PI染色和最分离标记和标记IdUr BrdUr。这些条件是理想的细胞周期动力学分析时,如潜在的倍增时间(Tdpot)和S期持续时间(Ds)。如果一个人只有欲望标记指数(比例的细胞标记核酸模拟)和/或细胞表面染色,另一种方法不使用胃蛋白酶消化更合适。

几乎所有的染色方法与BrdUr或其他核酸类似物使用相同的细微变化技术。在所有的方法中,第一步是把细胞与模拟。孵化的方法,即。,使用脉冲或脉冲/追逐或多个标签稍后讨论。其次,这种方法使用胃蛋白酶消化地带的细胞质细胞核。胃蛋白酶自然是发现在胃里,在稀释盐酸。胃蛋白酶必须稀释盐酸,必须在37°C的环境最有效地工作。胃蛋白酶是一种蛋白水解酶,所以基本上拳洞吃跨膜蛋白的磷脂膜。这就是为什么重要的是漩涡胃蛋白酶孵化后的细胞——剪剩下的磷脂膜和细胞质细胞核。这种方法最困难的部分是优化胃蛋白酶消化。 This必须对于每一个细胞类型。精致的单个细胞如淋巴细胞需要降低胃蛋白酶浓度和更短的孵化时间比从实体肿瘤细胞。Underdigestion不会允许所有细胞质的剥离。Overdigestion将开始降低核膜的可行性。一个优化过程遵循之后。测试优化的最佳方式就是将细胞与PI染色后在荧光显微镜下观察细胞核的状态。第三步,一个常见的方法,是孵化与相对集中(2 n)盐酸。这一步是非常重要的,因为它水解DNA,使整合模拟访问抗体和相对大的荧光染料。使用缓冲用洗涤剂如Tween-20或Triton-X保持所有访问。

由:弗吉尼亚斯奈尔

引用:

白色,R.A.,a·波拉克和新罕布什尔州特里(1994)同时关联的非整倍性肿瘤和细胞因子的测量与Chlorodeoxyuridine二倍体细胞后连续的标签。血细胞计数15:311 - 319。

白色,R.A.和新罕布什尔州特里(1992)定量方法评价二元流仪获得的数据利用单克隆抗体溴脱氧尿苷。血细胞计数13:490 - 495。

特里,新罕布什尔州R.A.白色,马丁Meistrich, D.P.卡尔金斯(1991年)人口流动仪的方法确定评估潜在的使用培养细胞倍增时间。血细胞计数12:234 - 241。

特里,N.H.A.,R.A.白色,和马丁Meistrich()细胞动力学:从Titriated胸苷,流式细胞术BJR增刊24:153 - 157。

特里,N.H.A.(1995)放射治疗的肿瘤细胞动力学参数的预测价值:考虑有关数据生产和分析。临床肿瘤学杂志13:1833 - 1836。

J.C.卡尔顿,N.H.A.特里和R.A.白色(1991)使用流式细胞仪测量小鼠肿瘤的潜在翻倍。血细胞计数12:645 - 650。

波拉克,N.H.A.特里、C.S.吴B.M.明智,R.A.白色和马丁Meistrich(1995)的特定染色Iododeoxyuridine肿瘤体内双标记:一个细胞动力学分析。血细胞计数20:53 - 61。

1. 细胞用BrdUTP标记(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)的浓度10µM 60分钟(时间可以根据不同的细胞类型和文化条件)。
2. 细胞与冷hbs洗一次。
3. 2毫升的细胞颗粒resuspended冷哈佛商学院和细胞悬液转移到60 x 15毫米聚苯乙烯培养皿(美国康宁纽约)。菜然后直接放置于玻璃表面Fotodyne UV 300分析DNA透照器,包含四个15 w的灯泡(Fotodyne, Inc .,新柏林,WI,美国)提供最大在300 nm波长照明。细胞暴露于紫外线5分钟。
4. 细胞然后离心机,固定在冰冷的70%甲醇和储存在4°C长达四天。
5. 在PBS细胞水化,洗两次。
6. 细胞颗粒(约1 x 10⁶)涂抹删除所有多余的浮层。负反应的颗粒在50µL resuspended缓冲区包含:10µL 5 x缓冲溶液(1米甲次砷酸盐钾;125毫米Tris-HCl, pH值6.6;1.26毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA);5µL 25毫米氯化钴;0.5µL(12.5单位)dt(所有从勃林格曼海姆,印第安纳波利斯,美国),和0.25 nmol BrdUTP(σ)补充道。
7. 在37°C细胞孵化60分钟。反应停止洗细胞两次15毫米EDTA-NaOH, pH值7.8。
8. 100年对细胞培养的解决方案包含0.7µgµL FITC-conjugated anti-BrdUrd单克隆抗体(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲克隆B44), 0.1% triton - x - 100和1% BSA(σ)。细胞与上述缓冲洗两次单克隆抗体(-)。
9. 细胞复染色5µg /毫升π的核糖核酸酶(李et al。1995年,血细胞计数20:172)。

引用李:X, Troganos F。问题,核磁共振,Darzynkiewicz z (1994) 5-bromo-2-deoxyuridine纳入DNA的检测标记链断裂引起的光解(SBIP)。Int 4:1157 - 1161 j .杂志。

1. 文化条件和设备:
   
   • 培养瓶250毫升包裹在铝箔
   • 25毫升Iscoves介质
   • 10毫米BrdUr
   • 文化1 e7 Ficoll-separated细胞30分钟37°C
     
2. 离心机在200 x g 10分钟10°C。去除浮层。
3. 解决颗粒冰冷2毫升70%乙醇。商店在4°C长达一个月。
4. 离心机在200 x g 10分钟10°C。去除浮层。
5. 加入2毫升乙醇pH_结核病30分钟在4°C。
6. 加入2毫升PBTB。
7. 离心机在200 x g 10分钟10°C。去除浮层。
8. 加入2毫升PBS (pH值7.2)。
9. 离心机在200 x g 10分钟10°C。去除浮层。
10. 加入250毫升PBS (pH值7.2)+ 20毫克/毫升propidium碘。
11. 测量细胞FACScan BrdUr / DNA含量。

提供的博士:Hans-Dieter Kleine

1. 根据之前的协议聚蔗糖骨髓。
2. 调整细胞浓度5 x 10⁴细胞/µL PBS。
3. 用50µL这个细胞悬液为以下步骤或用所有提到的数量与一个合适的号码。
4. 孵化30分钟在冰表面抗原抗体:同形像控制正常immunophenotyping准备的一样。
5. 洗两次2毫升的PBS。
6. Resuspend 1毫升PBS的颗粒,轻轻漩涡。
7. 冰冷加1毫升的2%多聚甲醛在PBS涡流示例(最终浓度1%)。孵化冰上1小时。与PBS洗两次。
8. Resuspend 1.9毫升的0.9%的颗粒正常生理盐水。孵化冰上30分钟然后添加0.1毫升Tween-20 10%生理盐水,轻轻地漩涡。
9. 增加60µL赫斯特33343股票的解决方案在生理盐水(100µg /毫升)。孵化隔夜在冰箱里。
10. 在早上阅读样本流。

简历的G₀/ G₁峰值应小于5%,提供了荧光染料领域产生了一个简历不到4%的紫外线参数。散射和染色性能不应该差别很大从新鲜彩色样本。

1。根据之前的协议聚蔗糖骨髓。
2。调整细胞浓度5 x 104细胞/µL PBS。
3所示。用50µL这个细胞悬液为以下步骤或用所有提到的数量与一个合适的号码。
4所示。孵化30分钟在冰表面抗原抗体:同形像控制正常immunophenotyping准备的一样。
5。洗两次2毫升的PBS。
6。Resuspend 1毫升PBS的颗粒,轻轻漩涡。
7所示。冰冷加1毫升的2%多聚甲醛在PBS涡流示例(最终浓度1%)。孵化冰上1小时。与PBS洗两次。
8。Resuspend PBS的颗粒在1.9毫升。添加0.1毫升的10% Tween-20在正常生理盐水,轻轻地漩涡。在冰上孵化15分钟。
9。在PBS洗两次。
10。加10 uL的bcl - 2 FITC (DAKO)抗体在50 - 90µL细胞悬液,在冰上和孵化15分钟。还加10µL同形像控制适当的管。
11。在生理盐水洗两次和resuspend 1.9毫升的生理盐水。
12。在冰上孵化为30分钟。
13。添加0.1毫升Tween-20 10%生理盐水,轻轻地漩涡。增加60µL赫斯特33343股票的解决方案在生理盐水(100µg /毫升)。孵化冰箱里过夜,早上和运行示例。

1. 溶解整个骨髓non-fixing赖氨酸的解决方案。岩石轻轻地5 - 10分钟。
2. 自旋(1500转/ 5分钟)。请注意再次:您可能需要添加赖氨酸溶液1分钟如果有红色颗粒细胞。
3. 洗细胞与温暖的介质(RPMI 1640 + 1毫米玫瑰,+ 2% FCS +笔/喉炎的症状)。
4. 计数细胞的数量。
5. 在媒介2.5 x 10细胞悬液⁶细胞/毫升。
6. 整除1毫升的这个细胞悬液为下面的管子:
   
   # 1)IgG1-FITC / IgG1-PE / IgG1-TC
   
   # 2)IgG1-FITC / IgG1-PE / IgG1 + IgG2a-GAM-TC
   
   # 3)IgG1-FITC / IgG1-PE / LINEAGE-GAM-TC
   
   # 4)CD45-FITC / IgG1-PE / IgG1 + IgG2a-GAM-TC
   
   # 5)IgG1-FITC / CD38-PE IgG1 + IgG2a-GAM-TC
   
   把这些管子放在冰赔偿污点。
   
   
7. 整除4毫升的细胞悬液为下面的管子:
   
   X4 # 6 (A, B, C, D) CD34-FITC / CD38-PE / LINEAGE-GAM-TC
   
   X3 # 7 (A, B, C) CD34-FITC / CD95-PE / LINEAGE-GAM-TC
   
   X1 # 8) (IgG1/4E3) / CD34-PE / LINEAGE-GAM-TC
   
   X1 # 9) (IgG1/4E3) / CD34-PE / CD38-TC
   
   添加赫斯特染料在每4毫升。孵化20µL 37°C在黑暗中为90分钟。
   
   
8. 自旋的细胞,从步骤5和6。洗1 x冷缓冲区(hbs + 1毫米玫瑰+ 2% FCS +笔/喉炎的症状)。
9. Resuspend冷的颗粒在100年µL清洗解决方案。管# 1和9在冰上。51µL血统的鸡尾酒添加到适当的管:
   
   血统鸡尾酒是由以下抗体:
   
   CD61 Caltag 1 uL /测试CD56 Caltag 5µL
   
   CD16 Caltag 1 uL CD33 BD 5µL
   
   CD10 Caltag 1 uL CD66b Immunotech 5µL
   
   CD19 Caltag 2 uL CD4 Immunotech 10µL
   
   CD11b Caltag 2 uL CD8 Immunotech 5µL
   
   CD41 Caltag 2 uL CD22 Immunotech 5µL
   
   CD13 Caltag 2 uL GlyA Dako 5µL
   
   控制管,加3µL每个纯IgG1 IgG2a Caltag。
   
   
10. 培养细胞在冰上15 - 30分钟。洗1 x 2 - 3毫升冷缓冲区。Resuspend颗粒100年µL寒冷的缓冲区。加10µL GAM-TC每管。在冰上孵化15 - 30分钟。添加2µL GAM-TC补偿管。洗1 x 2 - 3毫升冷缓冲区。
11. 80年Resuspend颗粒缓冲µL冷。添加20µL老鼠血清。在冰上孵化15分钟。小鼠血清块上的任何免费受体网站访问,并与其他鼠标是必要的,当染色后反人类抗体GAM。洗细胞1 x 2 - 3毫升冷缓冲区。
12. 在100年µL Resuspend颗粒。增加100µL额外缓冲管# 8和9。这些管子分割成两个额外的管(A和B)。加5µL IgG1-FITC管一个4和5µL e3-fitc(印)管B添加适当的其他直接共轭抗体。孵化15 - 30分钟,清洗1 x 2 - 3毫升冷缓冲区。
    
    将管:
    
    # 8)IgG1-FITC / CD34-PE / LINEAGE-GAM-TC
    
    # 8 b) 4 e3-fitc / CD34-PE / LINEAGE-GAM-TC
    
    # 9)IgG1-FITC / CD34-PE / CD38-TC
    
    # 9 b) 4 e3-fitc / CD34-PE / CD38-TC
    
    
13. Resuspend颗粒在寒冷4毫升缓冲区。商店在4°C到排序。

单击下面的红色的加号,查看每个条目的标准操作程序。

遵循相同的协议用于细胞的细胞周期分析。凋亡细胞的数量将会有相同的RNA含量的活细胞,但sub-G₀/ G₁DNA含量。

遵循相同的用于细胞的细胞周期分析。细胞的凋亡人口sub-G₀/ G₁DNA DNA直方图上的内容。

APOPTEST-FITC凋亡工具包(Nexins研究B。乐动体育LDsports中国V, # A700)

这个协议的同步检测的表面标记和磷脂酰丝氨酸暴露绑定的膜联蛋白V-FITC。

1. 此步骤仅供患者样本,不需要培养细胞。溶解外周血或骨髓nonfixing赖氨酸溶液根据协议。
2. 此步骤仅供患者样本,不需要培养细胞。培养细胞15毫升0.9%生理盐水含有5毫米EDTA (pH值7.4)15分钟在冰上。这释放任何内源性膜联蛋白V绑定到PS,以及血小板释放会造成错误的积极性。洗细胞一旦冷PBS。
3. 整除细胞适当标记为PE管污点和/或PERCP或三共轭表面标记根据适当的协议。
4. 洗细胞一旦冷PBS。吸干颗粒很好去除上层清液就不会破坏绑定缓冲的钙离子浓度增加。
5. 增加200µL绑定缓冲颗粒(大约10⁵-10年⁶总细胞)。加上2µL膜联蛋白V-FITC和孵化冰在黑暗中10分钟。保留管没有膜联蛋白,用自体荧光的细胞作为消极的控制流。直接看样品。
6. 可选:添加propidium碘(股票:100µg /毫升)膜联蛋白/绑定缓冲溶液在最后5µg /毫升的浓度。在冰上孵化10分钟,直接读取流。

特别注意事项:
只有新鲜的样品用于自发凋亡,没有一夜之间存储或使用冷冻细胞。不修复或permeabilize细胞,这将引发错误的积极性由于暴露内心的传单上的PS的细胞膜。使用绑定缓冲在染色膜联蛋白V是至关重要的,因为膜联蛋白需要生理浓度的钙结合。另外,细胞培养基或熟知的缓冲区可能被使用,因为它们包含相同的钙含量绑定缓冲。不要使用绑定缓冲超过四个星期,因为它可能会导致假阳性结果,可能由于pH值问题。应该使用碘化propidium区分坏死细胞(假阳性)凋亡细胞。

由:奥利弗博士Kliche /斯奈尔维吉尼亚

引用:

Fadok VA, Voelker博士,坎贝尔,科恩JJ,布拉顿DL和亨森(1992)下午暴露phosphotidyl丝氨酸凋亡淋巴细胞表面的触发特定的巨噬细胞识别和清除。J Immunol 148, 2207 - 2216。

1. 可选:对于表面标记染色,染色细胞所需的表面标记和适当的同型的控制30分钟在冰上。与PBS洗一次。
2. 固定:混合2 x PBS一部分一部分2%多聚甲醛(methanol-free)。慢慢地增加导致1%多聚甲醛细胞而轻轻涡流。孵化在4°C至少一个小时。如果使用PE-Cy5串联共轭染料表面标记,最好的结果是实现如果细胞保持在1%多聚甲醛,直到TUNEL过程。
3. 洗2 * 4毫升PBS。
4. 透化作用:如果不做表面标记染色,修复细胞,冰冷的70%乙醇而轻轻涡流。细胞可能存储在-20°C 70%乙醇两周或更长时间。如果使用表面标记,最好的结果是通过与Triton-X permeabilizing细胞膜。Resuspend 0.1%的颗粒500µL Triton-X在PBS,轻轻地和漩涡。在冰上孵化15分钟。洗两次4毫升冷PBS。
5. 计算样本的数量。使至少一个足够的缓冲超过实际样本的数量。添加适量biotin-16-dUTP和dt酶缓冲(所有遵循食谱)。添加40µL缓冲细胞的反应。控制反应缓冲+ biotin-16-dUTP没有TdT酶。孵化管在37°C一小时。洗细胞4毫升的PBS的两倍。
6. 使至少一个足够的抗生物素蛋白混合样本比样品的实际数量(配方之前)。增加100µL卵白素混合样品。在室温下孵化在黑暗中30分钟。洗两次4毫升的PBS。
7. 在PBS Resuspend细胞流式细胞术。
8. 可选:细胞周期分析,加碘化propidium最后5µg /毫升的浓度。在室温下孵化在黑暗中30分钟。阅读在流式细胞分析仪。

   TUNEL缓冲

   • 20µL 5 x缓冲区
   • 10µL 10 x CoCl
   • 70年µL dH₂O

   TUNEL缓冲反应混合

   负反应混合

   • 40µL TUNEL缓冲
   • 0.6µL biotin-16-dUTP
   • 0.3µL TdT)酶/个人样本

   控制反应混合

   使新鲜。

   • 40µL TUNEL缓冲
   • 0.6µL biotin-16-dUTP
   • 每单个样本100µL缓冲区

   抗生物素蛋白

   抗生物素蛋白缓冲

   过滤和储存在4°C。

   • 4 x SSC
   • BSA 1% (w / v)
   • 添加列表项

   抗生物素蛋白混合

   使新鲜。

   • 100 uL卵白素缓冲
   • 1 uL卵白素FITC(正)
   • 0.5% Triton-X 100每个样本
   注意:5 x缓冲区,10 x CoCl TdT)酶和biotin-16-dUTP来自勃林格曼海姆。

1. 可选的,表面染色:染色细胞使用标准表面染色协议使用PE和/或三/ PERCP颜色单克隆抗体。
2. 细胞与2毫升1%多聚甲醛固定在PBS (pH值7.4)15分钟在4°C。与PBS洗两次。可以存储在4°C。
3. 离心样品。再水化颗粒在PBS。离心机。去掉上层清液和吸干颗粒。
4. 细胞在50µL resuspended甲次砷酸盐缓冲含有0.2卡可基酸盐钾,2.5毫米Tris-HCl (pH值6.6),2.5毫米CoCl₂0.25毫克/毫升BSA 7单位负2和0.5µM biotin-16-dUTP。细胞培养在37°C 1小时。与PBS洗两次。去掉上层清液和吸干颗粒。在缓冲控制管resuspended Tdt酶。
5. Resuspend颗粒在100年µL制成的缓冲4 x SSC Triton x - 100, 0.1% 1% BSA和2.5µg /毫升卵白素FITC。孵化在黑暗中在室温下30分钟。洗两次细胞与PBS Triton x - 100年的0.1%。
6. 可选的,DNA:500年µL PBS Resuspend细胞。添加100µL赫斯特33342年股票在PBS + 10%(10µg /毫升渐变20)导致的最终浓度0.5µg /毫升。在4°C孵化8小时。

TUNEL技术仍然是黄金标准检测细胞凋亡的细胞内,尽管新方法检测细胞凋亡的早期阶段。该方法直接相当于TUNEL技术除了BrdUTP是代替biotin-dUTP。BrdUTP几乎是三个数量级比biotin-dUTP便宜,几乎是一个日志比biotin-dUTP光明的强度。

1. 所需的治疗后或文化条件下,细胞颗粒状和固定在1% methanol-free甲醛(Polysciences, Inc .,沃灵顿,PA,美国)在汉克的缓冲盐溶液(hbs) 15分钟在冰上。细胞是离心机和哈佛商学院洗一次。
2. 细胞颗粒然后你找找冰冷的70%乙醇和储存在-20°C长达四天。
3. 在PBS细胞水化,洗两次。
4. 细胞颗粒(约1 x 10⁶)是尽可能删除所有多余的supernatent涂抹。负反应的颗粒在50µL resuspended缓冲区包含:10µL 5 x缓冲溶液(1米甲次砷酸盐钾;125毫米Tris-HCl, pH值6.6;1.26毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA);5µL 25毫米氯化钴;0.5 uL(12.5单位)dt(所有从勃林格曼海姆,印第安纳波利斯,美国),和0.25 nmol BrdUTP(σ)补充道。
5. 在37°C细胞孵化60分钟。反应停止洗细胞两次15毫米EDTA-NaOH, pH值7.8。
6. 100年对细胞培养的解决方案包含0.7µgµL FITC-conjugated anti-BrdUrd单克隆抗体(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲克隆B44), 0.1% triton - x - 100和1% BSA(σ)。细胞与上述缓冲洗两次单克隆抗体(-)。
7. 细胞复染色5µg /毫升π的核糖核酸酶(李et al。1995年,血细胞计数20:172)。

通过流式细胞仪检测凋亡细胞DNA链断裂的标签使用不同的方法。二元分布(等距等高线地图)的DNA含量与DNA链断裂标签代表指数增长HL-60细胞培养3 h和0.15µM camptothecan优先(美联社)凋亡的细胞通过S期(Del Bino进展et al。,1991)。前三个面板左边代表间接标记的DNA链断裂,利用BrdUTP, digoxygenin共轭dUTP (d-dUTP)或生物素化的dUTP (b-dUTP)。两个右面板显示细胞分布后直接单步DNA链打破标签,与BDIPY或FITC共轭dUTP。注意指数纵坐标的规模。最伟大的分离明显,实现从non-apoptotic细胞凋亡DNA链断裂后与BrdUTP标签。

引用:标签与BrdUTP DNA链断裂。检测细胞凋亡和细胞增殖。李(1995)x和Z Darzynkiewicz。细胞增殖28:571 - 579。

在幻灯片TUNEL分析(ApopTag®+包[1厘米x 1.5厘米面积))

固定

1. 修复细胞利用BD赖氨酸溶液在4°C 10分钟(1.5%甲醛)。
2. 洗细胞1 x在PBS、干燥、冻结在-20°C。
3. 在室温下解冻的幻灯片。
4. 修复幻灯片在3:1混合的甲醇:乙酸为5分钟。
5. 增加约40µL平衡缓冲(用盖玻片)。酝酿至少30分钟。
6. 应用的工作强度TdT(19µL的混合物反应缓冲和8µL dt酶。涡在微型离心机管)。孵化幻灯片在37°C 1小时。
7. 用PBS清洗幻灯片3 x 5分钟。

检测

1. 增加工作强度抗体溶液(19µL阻塞的混合物溶液和16µL Anti-Digoxigenen-Fluorescein。涡在微型离心机管)。在黑暗中孵化幻灯片一小时。
2. 洗3 x与PBS。
3. 用DAPI复染色(准备通过混合1µL / 50毫升的股票的解决方案,并添加H₂O)、盖玻片幻灯片和让他们1 - 2分钟。
4. 用自来水清洗幻灯片和干燥的空气。
5. 应用一滴不变色(Vectashield)每个幻灯片和盖玻片。
6. 显微镜下检查幻灯片使用60 x镜头。

由:凯瑟琳娜Clodi博士

描述

PhiPhiLux是Caspase-3 heptapeptide衬底它们包含两个成为衬底的荧光在乳沟。发射max = 530海里(Fl1)与488 nm激光。兴奋时

试剂

• PhiPhi勒克斯试剂(OncoImmunin Inc .,大学公园,MD)
• 磷酸缓冲盐(PBS)
• Propidium碘化

过程

1. 转移3 - 5 x 10⁵细胞流式细胞仪管。
2. 与PBS洗细胞两次,resuspend细胞颗粒残留PBS。
3. 添加5µl PhiPhi勒克斯试剂,孵化为1小时37°C。
4. 用冷PBS。
5. Resuspend细胞0.5毫升冷PBS,加1µl 2毫克/毫升propidium碘对活细胞的控制。
6. 流量分析:Fl1 PhiPhi勒克斯荧光测量。细胞与caspase-3活动将有一个Fl1荧光明显高于那些没有活动。

由:Irina Stiouff和道格拉斯·怀德

试剂

• CMX-Ros(水户跟踪红、分子探针,尤金,或者)
• DMSO溶液
• 磷酸缓冲盐(PBS)

CMX-Ros试剂准备

提供试剂作为冻干粉50µg整除。准备一个1毫米股票通过添加94µl DMSO冻干粉,并存储在-20°C。股票稀释浓度的30 nM RPMI介质加热到37°C之前染色。

过程

1. 转移3 - 5 x 10⁵细胞流式细胞仪管。
2. 与PBS洗细胞两次,resuspend细胞颗粒残留PBS。
3. 增加300的30 nM CMX-Ros / RPMI - 500µl 37°C。
4. 培养细胞为1小时37°C。
5. 颗粒细胞和洗冷PBS。
6. 增加500µl PBS最终细胞颗粒,并保持在冰上,直到流分析。
7. 流量分析:测量CMX-Ros荧光在FL3 (Em max = 599海里)。细胞线粒体膜电位出现的破坏作为一种独特的与减少FL3荧光峰。

由:Irina Stiouff和道格拉斯·怀德

参考:男子气概et al。血细胞计数25 (1996),333

在线粒体膜电位高,JC-1形成了所谓的“J-aggregates”Fl发射最大的590海里(Fl 2)。当线粒体膜电位是中断,发生在细胞凋亡、JC-1成为单体的,和排放最大的单体在525 nm (Fl 1)。因此,脂肪肝的转变从红色绿色表明线粒体膜电位的损失。

试剂

• JC-1(分子探针,尤金,或者)
• DMSO溶液
• 磷酸缓冲盐(PBS)

JC-1试剂准备

固体形态的试剂提供5毫克的单位。准备一个5毫克/毫升股票通过添加1毫升DMSO的固体JC-1,并存储在-20°C。股票稀释到5µg /毫升的浓度在PBS prewarmed染色前37°C。(5毫克/毫升= 7.7毫米)

过程

1. 转移3 - 5 x 10⁵细胞流式细胞仪管。
2. 与PBS洗细胞两次,resuspend细胞颗粒残留PBS。
3. 增加300 - 500 5的µlµg /毫升JC-1。
4. 培养细胞为10分钟37°C。
5. 颗粒细胞和洗冷PBS。
6. 增加500µl PBS最终细胞颗粒,并保持在冰上,直到流分析。
7. 流量分析:测量Fl1和Fl2荧光。细胞有破坏线粒体膜电位表现为明显的绿色转移人口当策划Fl1 vs Fl2。

由:道格拉斯·怀德

参考:Salvioliet al。,2月列托人411 (1997)77 - 82

单击下面的红色的加号,查看每个条目的标准操作程序。

试剂和抗体

• 美国公共电视台
• 100%的甲醇
• 多聚甲醛
• Lysolithin (L-alpha lysophosphatidylcholine)(σ# l - 4129)
• 诺乃清洁剂(NP40)(σ# N3516)
• 核糖核酸酶(卫氏生化集团# lfo - 5679)
• 牛血清白蛋白(BSA)分数V(σ)
• Propidium碘(σ# p - 4170)
• Anti-PCNA Boehringer曼海姆生化药剂(# 1170406)
• 正欲Goat-anti-Mouse FITC (GAM-FITC) (# 9031)
• MsIgG1同形像控制测试(100)(库尔特# 6602872)
• Paraformaldehyde-Lysolecithin解决方案(新):
  • 20 - 40µg /毫升溶血卵磷脂
  • 1%多聚甲醛在PBS没有钙和镁

过程

1. 丸1 x 10⁶在寒冷的PBS细胞和洗2次。使用1.5毫升聚丙烯埃普多夫管。
2. 孵化丸1毫升paraformaldehyde-lysolecithin解决方案在室温下2分钟。
3. 自旋(1.5分钟4000 rpm),吸入浮在表面的涡轻轻地阻止破坏细胞。
4. 孵化丸1毫升100%冰冷的冰甲醇5分钟。
5. 自旋下来,吸入上层清液和漩涡。
6. 孵化颗粒在PBS 1毫升0.1% NP40没有钙和镁5分钟在冰上。
7. 自旋下来,吸入上层清液和漩涡。
8. 培养细胞1µg(1µL) anti-PCNA单克隆抗体稀释µL PBS和100年的0.1% BSA在室温下30 - 60分钟。使用相同浓度的IgG1(5µL IgG1 195年µL PBS)同型的控制。
9. 轻轻旋转,吸入上层清液和涡。
10. 用0.5毫升PBS BSA为0.1%。
11. 增加1000台(10µL)核糖核酸酶和0.5毫升propidium碘在PBS(50µg /毫升)。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA
• 诺乃清洁剂(NP40)
• 70%的甲醇
• 多聚甲醛
• 核糖核酸酶
• π

抗体

• MsIgG1同型的控制,非结合的(库尔特# 6602872)
• ki - 67非结合的(DAKO # M722)
• 正欲Goat-anti-Mouse FITC (GAM-FITC) (# 9031)

过程

1. 球10⁶细胞,加1毫升多聚甲醛在PBS(1%)和在室温下培养5分钟。自旋。
2. 加1毫升70%冰冷的甲醇,孵化5分钟在-20°C。自旋。
3. 加1毫升NP40 PBS(0.1%),孵化5分钟在冰上。自旋下来,用PBS清洗两次。
4. 孵化与5µL ki - 67细胞单克隆抗体与50µL PBS稀释1% BSA对冰60分钟。
5. 与90年增加10µL GAM-FITC稀释µL PBS / BSA(1%) 30分钟在冰上。与PBS洗两次。
6. 添加500µL propidium碘(50µg /毫升)+核糖核酸酶(1000 U /毫升),孵化1小时或过夜。
7. 读取流。

试剂

• 3.54 g Na₂HPO₄在100毫升DDW(缓冲是0.2米)
• 1.37克不₂阿宝₄在100毫升DDW(缓冲是0.1米)
• 赖氨酸股票的解决方案:
  • 1.862 g赖氨酸盐酸盐在50毫升0.2 Na₂HPO₄
  • 7.4与0.1米不调整pH值₂阿宝₄
  • 占总量的DDW 100毫升
  • 存储在4°C
• 多聚甲醛股票的解决方案:
  • 9毫升Na₂HPO₄,19毫升不₂阿宝₄22毫升DDW 4 g多聚甲醛
  • 加热到60°C,添加2 n氢氧化钠,直到解决方案是明确的
  • 调整pH值为7.4
  • 存储在4°C
• Sodium-meta-periodate(σ)

抗体

• IgG1 FITC(正)
• ki - 67 FITC (DAKO # F788)
• 任何PE-conjugated单克隆抗体对抗原决定基表面

过程

1. 准备PLP-reagent: 7.5毫升的赖氨酸股票多聚甲醛溶液+ 2.5毫升股票sodium-meta-periodate + 21.4毫克。这个解决方案很好工作了七天。
2. 酝酿十⁶与PE-labeled细胞表面标记(参见immunophenotyping协议)。与PBS洗两次。
3. 细胞颗粒,加1毫升PLP-reagent,孵化15分钟在冰上。
4. 旋转细胞下来和PBS洗两次。
5. 加10µL ki - 67 FITC稀释40µL PBS / BSA (1%)。准备同型的控制。在冰上孵化为30分钟。洗两次冷PBS。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA
• 诺乃清洁剂(NP40)
• 70%的甲醇
• 多聚甲醛
• 核糖核酸酶
• Propidium碘化

抗体

• MsIgG1非结合的(库尔特# 6602872)
• p120单克隆抗体(库尔特)
• Goat-anti-Mouse FITC (GAM-FITC)(正)

过程

1. 球10⁶细胞,加1毫升多聚甲醛在PBS(1%)和在室温下培养5分钟。自旋。
2. 加1毫升冰冷的70%甲醇,孵化5分钟在-20°C。自旋。
3. 加1毫升NP40 PBS(0.1%),孵化5分钟在冰上。自旋下来,用PBS清洗两次。
4. 培养细胞2µL p120单克隆抗体与50µL PBS稀释1% BSA对冰60分钟。与PBS洗两次。
5. 与90年增加10µL GAM_FITC稀释µL PBS / BSA(1%) 30分钟在冰上。与PBS洗两次。
6. 添加500µL propidium碘(50µg /毫升)+核糖核酸酶(1000 U /毫升),孵化1小时或过夜。

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1. 根据之前的协议聚蔗糖骨髓。
2. 调整细胞浓度5 x 10⁴细胞在PBS / uL。
3. 使用50µL这对以下步骤细胞悬液,或把所有提到的数量与一个合适的数字。
4. 孵化30分钟在冰表面抗原抗体:同形像控制正常immunophenotyping准备的一样。
5. 洗两次2毫升的PBS。
6. Resuspend 1毫升PBS的颗粒,轻轻漩涡。
7. 冰冷的加1毫升的2%多聚甲醛在PBS涡流示例(最终浓度1%)。孵化冰上1小时。与PBS洗两次。
8. Resuspend PBS的颗粒在1.9毫升。添加0.1毫升的10% Tween-20在正常生理盐水,轻轻地漩涡。在冰上孵化15分钟。
9. 在PBS洗两次。
10. 添加10µL bcl - 2 FITC (DAKO)抗体在50 - 90µL细胞悬液,在冰上和孵化15分钟。还加10µL同形像控制适当的管。
11. 在生理盐水洗两次和resuspend 1.9毫升的生理盐水。
12. 在冰上孵化为30分钟。
13. 添加0.1毫升Tween-20 10%生理盐水,轻轻地漩涡。增加60µL赫斯特33343股票的解决方案在生理盐水(100µg /毫升)。孵化冰箱里过夜,早上和运行示例。

1. 从1.5 x 10⁶白细胞3.7毫升没有浮在表面的锥形塑料试管触底。
2. 修复细胞1毫升100%冰冷的甲醇,增加细胞涡流轻轻。继续涡直到颗粒分解。
3. 冻结在-20°C细胞完全10分钟。
4. 添加50µL PBS的钙、镁、整个山羊血清BSA为1%和1%。在室温下让坐30分钟。偶尔漩涡。
5. 添加50µL anti-Ras抗体在PBS稀释1:98 1% BSA和1%整个山羊血清。孵化冰上30分钟。
6. 与PBS洗两次,大约50µL的上层清液。
7. 添加50µL rabbit-anti-rat抗体与PBS稀释1:10没有Ca, Mg, + 1% BSA, + 1%整个山羊血清。涡和孵化冰30分钟。
8. 与1毫升PBS洗两次,大约50µL上层清液。
9. 添加50µL卡佩尔GAM-FITC与PBS稀释1没有Ca, Mg, + 1% BSA, + 1%整个山羊血清。在黑暗中孵化冰上30分钟。
10. 洗两次,1毫升PBS。
11. 增加250µL 500 U /毫升高纯度核糖核酸酶。在黑暗中孵化在37°C 30分钟。
12. 增加250µL propidium碘(σ)直接管。
13. 细胞可以被储存在4°C到测量。

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凋亡表达

单一的颜色

1. 1 x 10⁶100年细胞resuspendedµL PBS 2µL MRK16 (Kamiya千橡市,CA)(鼠标IgG2a;1.0µg总摩押)。纯鼠标IgG2a (Caltag)在相同浓度用于控制(10 100年µL抗体µL细胞悬液)。培养细胞20分钟在冰上。洗一次冷PBS,离心法在330 x g 8分钟。
2. 细胞颗粒是100年resuspendedµL PBS的2µL Biotin-Goat反鼠标IgG2a抗体(南方生物技术、伯明翰、AL)(1µg总摩押)。培养细胞20分钟在冰上。洗一次冷PBS。
3. 100年Resuspend细胞颗粒µL PBS 4µL链霉亲和素结合RED613(加利福尼亚州圣何塞,正欲)20分钟在冰上。洗一次冷PBS。
4. 阅读蛋白表达正欲流在FL3 FACScan(激发在488年发射,613)。

多色

1. 1 x 10⁶100年细胞resuspendedµL PBS 2µL MRK16 (Kamiya千橡市,CA)(鼠标IgG2a;1.0µg总摩押)。纯鼠标IgG2a (Caltag)在相同浓度用于控制(10 100年µL抗体µL细胞悬液)。培养细胞20分钟在冰上。洗一次冷PBS,离心法在330 x g 8分钟。
2. 细胞颗粒是100年resuspendedµL PBS的2µL Biotin-Goat反鼠标IgG2a抗体(南方生物技术、伯明翰、AL)(1µg总摩押)。培养细胞20分钟在冰上。洗一次冷PBS。
3. Resuspend细胞要么纯山羊血清非特异性结合10分钟,或100µL PBS 5µL IgG2a(0.5µg摩押)。洗1 x冷PBS。
4. Resuspend细胞颗粒在100年与链霉亲和素共轭µL PBS RED613(加利福尼亚州圣何塞,正欲)和所需的PE和FITC共轭抗体。孵化20分钟在冰上。洗一次冷PBS。
5. 直接读取样品流。

注:分析样品,MRK16表达式的直方图上覆盖的控制。使用荧光差异评估Kolmogorov-Smirnov (KS)统计,D表示,衡量两个分布函数之间的区别并生成一个值从-1.0到1.0不等。该方法准确地识别荧光差异小,低水平凋亡检测是有用的表达式。MRK16染色强度分类如下:- (d < 0.10),暗(0.10 < d < 0.15),中等(0.15 < d > 0.25)和明亮的(d > 0.25)。

引用:

• C.P.利思et al。(1995)相关的多药耐药性(凋亡)蛋白表达与功能染料/药物在急性髓系白血病流出多参数流式细胞术:识别不整合凋亡/射流+和凋亡+ /流出情况。血86 (6)2329 - 2342。
• C.P.利思et al。(1997)在老年人急性髓系白血病:评估的多药耐药性(凋亡)和细胞遗传学区分生物子组与标准化疗明显不同的反应。血89 (9)3323 - 3329。

1. Resuspend约x 10⁶细胞在100年µL PBS。加5µL IgG2a-FITC同型的控制管和5µL 4 e3-fitc样品管。
2. 孵化15 - 30分钟在冰上。
3. 洗2毫升冷PBS。
4. Resuspend颗粒在200 - 300年µL冷PBS进行流式细胞仪分析。

注:同型的控制必须运行的4 e3 Kolmogorov-Smirnov统计可以做与MRK16(见上图)。的差值大于0.15被认为是积极的。多色流可能很容易地完成了4 e3-fitc。

1. 调整细胞浓度1 x 10⁶细胞/毫升RPMI + 10% FCS在37°C。
2. 500µL起点并添加500µL新鲜温暖中原始管。
3. 孵化2毫升以上的电池解决方案在下列情况下:
   
   5µg /毫升医嘱
   5µg /毫升医嘱+ 10µg /毫升维拉帕米
   10µg /毫升维拉帕米
   
   
4. 用500µL在不同的时间点。在寒冷的PBS离心机,resuspend颗粒。250年洗1 x, resuspend颗粒µL冷PBS。
5. 立即读取流。

1. 1 x 10⁶维拉帕米(10细胞preincubatedµg /毫升)和罗丹明- 123(0.5毫克/毫升)RPMI + 10% FCS 37°C。
2. 洗细胞与介质的两倍。
3. Resuspend细胞中不存在与否的罗丹明- 123 mdr抑制剂如维拉帕米(10µg /毫升)。
4. 执行一个整除立即测量,测量后每15分钟。

双重染色表面标记(PE -和PERCP-conjugated)是可能的,并允许相关的特定的细胞群。如果这是理想的,染色的表面标记染料流出之前应该做。

1. 悬浮细胞在10毫升的37°C中包含戴奥(C2) 3的最终浓度60 ng / mL。孵化样本37°C恒温水槽30分钟。自旋在4°C。Resuspend丸3毫升新鲜、温暖、dye-free媒介。把样品分成三个整除。地方一个样本被流冰立即读基线吸收。
2. 添加温暖,dye-free介质3毫升在剩余两个整除。增加环孢菌素A (CsA,山德士制药,巴塞尔瑞士)的最后一个浓缩的2.5µg / mL,或PSC833(山德士制药)的最终浓度1µg /毫升一个22管抑制泵。在37°C水浴孵化90分钟。洗细胞和介质在4°C和resuspend颗粒在4°C中。商店在冰流。
3. 多色分析,细胞可能与期望的聚乙烯,PERCP /彩色TRI-conjugated抗体和清洗介质在4°C。

注:DiOC2兴奋与发射波长488 nm 500海里,因此读取流FL1 FACScan正欲。DiOC2优于罗丹明- 123 (RH123)功能分析22 (p-gp)由于紧缩的高峰,因为只有通过p-gp注入,而RH123注入其他多药耐药性的蛋白质。当使用单一颜色的蛋白质功能分析,propidium碘可以添加到样本的最终浓度5µg /毫升10分钟前流区分死与活细胞。流出评估通过分析差异荧光在存在覆盖直方图的/没有使用Kolmogorov-Smirnov p-gp抑制剂(KS)统计。> 0.25的D值是用来定义流出积极。

引用:

• C.P.利思et al。(1995)相关的多药耐药性(凋亡)蛋白表达与功能染料/药物在急性髓系白血病流出多参数流式细胞术:识别不整合凋亡/射流+和凋亡+ /流出情况。血86 (6)2329 - 2342。
• C.P.利思et al。(1997)在老年人急性髓系白血病:评估的多药耐药性(凋亡)和细胞遗传学区分生物子组与标准化疗明显不同的反应。血89 (9)3323 - 3329。

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这个分析是基于细胞因子的原则作为他们的特定的配体受体在靶细胞的表面。

试剂

• Fluorokines(直接共轭荧光染料或biotin-conjugated)从研发系统,包括Fluorokine清洗解决方案。
• 标记细胞因子阻断实验

过程

1. 1卷25µL e5细胞孵育10µL 60分钟的共轭细胞因子在冰上。添加Fluorokine后摇匀。
2. 洗两次与Fluorokine清洗解决方案。(由股票的解决方案与PBS稀释1:10)。
3. 当使用生物素化的Fluorokine,添加10µL streptavidin-PE,孵化冰60分钟。
4. 清洗步骤2的两倍。

控制,标记细胞因子用于10米fluoresceinated细胞因子的过度:从相同数量的细胞,添加标记细胞因子,动摇了一个星期,在冰上孵化15分钟,加入Fluorokine和如上所述。

双标签

fluoresceinated /生物素化的细胞因子的可用性提供了可能性与其他表面标记双染色。双重染色遵循以下协议的bcl - 2癌蛋白。此外,对比染色与propidium碘可以执行。

该方法遵循的原则表面标记染色。例如,标签与一个描述的人类IL-3受体抗体。

试剂

• 美国公共电视台
• BSA
• IL-3受体抗体(由DNAX提供)
• IgG1同型的控制抗体(库尔特)
• Goat-anti-Mouse FITC (GAM-FITC)(正)

过程

1. 2 e5细胞+ IL-3受体抗体,添加到最后5µg /毫升的浓度。在冰上孵化为30分钟。
2. 与PBS洗两次。
3. 添加二级抗体:5µL GAM-FITC稀释的45µL PBS-BSA(1%)、孵化30分钟在冰上。
4. 与PBS洗两次。

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FDG = fluorescein-di-beta-galactopyranoside

溶解在3.8毫升5毫克DDW = 2毫米壁。

1. 准备细胞中(alpha-MEM + 10% FCS +抗生素),适应的浓度为10⁷细胞/毫升。
2. 100的µL FACS-tube细胞悬液,孵化37°C水浴5分钟。
3. 增加100µL 2毫米之氟- 18 -去氧葡萄糖摄取,prewarmed 37°C,混合和再次孵化1分钟在37°C。
4. 在冰,加上1800µL冰冷的等渗介质(alpha-MEM + FCS +抗生素);在冰上孵化为60分钟。

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9.1正常分离从冷冻骨髓CD34 +细胞

1. 正常骨髓冷冻袋:
   
   把袋子放到一个塑料有拉链袋。地方到37°C水浴和快速解冻直到只是泥泞的细胞。
   
   擦的港区袋和70%乙醇和插入一个无菌端口适配器。
   
   轻轻和尽快撤回的细胞悬液袋使用30 -或60与至少一个18-gauge针注射器,最好16-gauge。
   
   把针从注射器和20毫升细胞悬液转移到50毫升锥形管包含30毫升温暖(37°C)缓冲区而轻轻旋转。立即离心机。
   
   
2. 正常骨髓冻结管:
   
   在批工作4 - 5瓶(5毫升)。将瓶放入塑料有拉链袋。把袋子放到37°C水浴和快速解冻细胞直到船上的厨子。
   
   擦管和70%的乙醇。
   
   4 - 5瓶的内容转移到一个包含30毫升50毫升锥形管热缓冲而轻轻旋转。立即离心机。
   
   
3. 将上层清液从管仔细颗粒可能不紧密。轻轻刮管放松颗粒。填满每一个管50毫升温暖的缓冲区。涡轻轻混合细胞与缓冲区。离心机。
4. 重复步骤3,但细胞从两个管结合为一个文件。
5. Resuspend颗粒在40毫升温暖的缓冲区。涡轻轻混合细胞。如果有一个单一的细胞悬液,细胞可能Ficolled去除死细胞和粒细胞。如果有明显的“弦”的细胞,需要孵化暂停在37°C时轻轻摇晃,然后离心机。这需要重复直到单个细胞悬液。
6. 聚蔗糖,层20毫升的细胞悬液超过15毫升的室温聚蔗糖。离心机在1800 rpm 15 - 20分钟。
7. 从聚蔗糖清除单核细胞层。洗细胞与冷缓冲50毫升锥形管。离心机。
8. 结合所有管50毫升锥形管。用冷的缓冲填充至50毫升。删除一个小样本(少于100µL)计数细胞。离心机。
9. 去除浮层。轻轻刮颗粒。基于细胞总数、添加的冷量Miltenyi建议的缓冲区。然后添加推荐量的抗体(解决方案A1和解决方案A2间接mac包)。涡轻轻混合细胞和抗体。
10. 培养细胞在冰箱里15分钟。填充管50毫升冷缓冲区和离心机。用50毫升清洗一次冷缓冲区。
11. 去除浮层。轻轻刮颗粒。基于细胞总数、添加冷Miltenyi推荐的。然后添加推荐量的抗体间接mac电脑工具包(解决方案B)。涡轻轻混合细胞和抗体。
12. 培养细胞在冰箱里15分钟。填充管50毫升冷缓冲区和离心机。
13. 去除浮层。轻轻刮颗粒。添加足够的冷缓冲细胞给最后一个细胞的浓度大约x10⁸细胞/毫升VS列和1 x10⁷对RS列。
14. 用冷脱气缓冲加载列。
15. 筛选细胞悬液在30-um尼龙网过滤器。保留少量的细胞悬液和记录准确的体积质量保证和质量控制(QA / QC)。
16. 添加细胞悬液。根据Miltenyi的指示进行分离。积极的部分在第二列如果需要更高的纯度。
17. 保留少量的最后一部分为QA / QC和记录的卷。

mac电脑的缓冲

• 汉克的平衡盐溶液(hbs) ca^{+ 2},毫克^{+ 2}
• 0.5% BSA
• 0.6%枸橼酸抗凝葡萄糖-公式(ACD-A)(百特)
• 100 U /毫升肝素
• 100 - 200 U /毫升DNAse(使用前必须直接添加)
• 过滤消毒和储存在4°C

注:冷冻骨髓分离的最重要的任务是实现单个细胞悬液。这是主要的DNase缓冲区来实现的。为了达到这个目的,您可能想要有200 U /毫升DNase缓冲聚蔗糖的一步。你可能会减少到100 U /毫升浓度后去除单核细胞层。我通常使用100 U /毫升的整个过程。,如果你发现你有一个特别沉重的样本,你可以增加DNase - 200 U /毫升,但并不高。是非常重要的,细胞仍然冷聚蔗糖。理想的细胞将寒冷的整个过程来维持细胞生存能力,但DNase就抢占的必要性。

看到Miltenyi插入来自该公司的信息。

9.1 b正常CD34的分离⁺细胞从新鲜pheresis动员干细胞

1. Resuspend样本100毫升的mac缓冲区(参见下面的食谱)。整除两个50毫升锥形管。离心10分钟1000 rpm”颗粒软旋转”。软旋转使血小板,集中在pheresis样本,在上层清液。血小板造成重大问题的染色样品以及样品的运行通过磁柱。supernantant必须吸气,不是倒了,由于颗粒松散。
2. 如果软的上层清液旋转仍相对阴,柔软的旋转可能重复。
3. ACD-A pheresis细胞样品的密度变化使粒细胞留在聚蔗糖的间期。尽管pheresis样品有高浓度的粒细胞,更重要的是消除前血小板激活。另一个协议可能是样品是最初没有ACD-A然后Ficolled悬浮在缓冲区。单核细胞层是resuspended与ACD-A缓冲区,和柔软的旋转。我们发现,最好离开粒细胞和调整浓度的抗体(之前)。
4. 计数细胞的总数。样本合并成一个50毫升的锥形管。Miltenyi列表抗体量根据细胞的总数;然而,这可能是根据估计的调整数量的细胞阳性分选参数。自从pheresis CD34 1 - 10%⁺细胞,我们通常用抗体的推荐量的50%。如果聚蔗糖不执行,这可能会降低抗体的数量,但缓冲不应低于,孵化时间应该延长到30分钟。添加量的缓冲Miltenyi推荐的。添加试剂的数量A1,轻轻摇晃。添加试剂A2的推荐量,轻轻摇晃。冰箱里孵化15分钟,轻轻摇晃定期的示例。
5. 洗50毫升的样品两次mac缓冲区。
6. Resuspend _推荐的样本数量的缓冲区,和_试剂B,轻轻摇晃。冰箱里孵化15分钟,轻轻摇晃定期的示例。
7. 洗一次的示例50毫升的mac电脑缓冲区。
8. Resuspend至少10毫升的样品脱气(见注)mac缓冲区1 x 10⁹总细胞,2 x 10或20毫升⁹总细胞。运行样例与积极的选择列。
9. 洗2 x 3毫升的脱气缓冲。
10. 把龙头和注射器的比列。从磁铁删除列。反冲列6毫升的脱气缓冲。在磁铁取代列。
11. 删除龙头。通过列允许缓冲流。洗2 x 3毫升的缓冲区。
12. 从磁铁删除列。添加6毫升缓冲列并允许运行通过。添加6毫升缓冲列和列。
13. 计数细胞收集的总数从每个分数来计算分离的复苏。
14. 对收集到的分数来评估执行流式细胞术样品纯度CD45-FITC和CD34-PE(正)。

mac电脑的缓冲

• 汉克的平衡盐溶液(hbs) ca^{+ 2},毫克^{+ 2}
• 0.5% BSA
• 0.6%枸橼酸抗凝葡萄糖-公式(联盟)(百特)
• 过滤消毒和储存在4°C

注:运行磁柱时是非常重要的,只有脱气mac缓冲区被使用。德加缓冲,将100毫升一瓶150毫升的缓冲区。放置一个橡皮塞连接到真空线在瓶子的口。打开真空。允许缓冲德加在室温下至少30分钟。取代上限瓶直到冷和冷藏缓冲区。使用缓冲区作为指导。

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1. 细胞固定2 x甲醇:乙酸,3:1,掉在一个幻灯片。预处理的幻灯片是非常重要的细胞从淋巴结或其他组织准备。
   
   2分钟2 x SSC
   5分钟Triton-X /盐酸
   5分钟PBS
   5分钟PBS / MgCl₂(% 1 m MgCl毫升₂+ 95毫升PBS)
   5分钟甲醛1%(1.35毫升37%甲醛+ 48.7毫升MgCl₂/ PBS)
   5分钟PBS
   乙醇系列(70%、85%、100%)
   风干的幻灯片
   
   
2. 探测鸡尾酒:7µL CEP缓冲区(Imagenetics附带着丝粒染色体)
   
   1µL 7号染色体着丝粒探针
   2µL着丝粒染色体3 (Cy3) (Oncor)
   
   漩涡。变性在73 oc 5分钟。
   
   
3. 热Coplin Jar 70%甲酰胺/ 2 x SSC 37°C。变性幻灯片3分钟。立即把幻灯片在冰冷的酒精系列3分钟(70%、85%、100%)。
4. 杂交过夜。
5. 洗3 x 5分钟65%甲酰胺/ 2 x SSC在37°C Coplin Jar。
   
   1 x 8分钟2 x SSC在37°C
   1 x 5分钟4 x SSC /渐变20
   
   
6. 复染色与DAPI 1毫升每个幻灯片1到2分钟。轻轻洗与正常H₂O和干燥的空气。
7. 加1滴不变色(Vectashield)和添加盖玻片。
   
   杂交两夜。
   
   
8. 洗3 x 5分钟50%甲酰胺/ 2 x SSC 42°C Coplin Jar。
   
   3 x 5分钟0.1 x SSC在60摄氏度
   阻塞的非特定的绑定4 x SSC渐变BSA 20 + 5% / 0.2%
   1:200 avidin-FITC(向量抗体)
   1:200 anti-avidin生物素化的
   
   
9. 所有抗体稀释4 x SSC 20 / BSA /渐变。
   
   抗生物素蛋白FITC 30分钟
   
   
10. 洗3 x 5分钟4 x SSC /渐变20
    
    Anti-Avidin FITC 45分钟
    
    
11. 洗3 x 5分钟4 x SSC /渐变20
    
    Avidin-FITC 30分钟
    
    
12. 洗3 x 5分钟4 x SSC /渐变20
13. 复染色与DAPI 1毫升每个幻灯片1到2分钟,轻轻洗与正常H₂O和干燥的空气。
14. 加1滴不变色(Vectashield)和添加盖玻片。

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PCR条件

1.0总RNA的µg 10µL用于逆转录反应。二十分之一的反应用于PCR反应。的总量是25µL PCR反应。的最终浓度biotin-labeled凋亡,B2-M底漆和TBR-labeled凋亡B, B B2-MµM底漆是0.2,0.2米的核苷酸,2.5µL 10 x反应缓冲和1.5 U。

1. 旋转离心细胞200 x与PBS g。洗两次。
2. 在1.5毫升PBS Resuspend颗粒。添加0.5毫升的4%多聚甲醛在PBS轻轻地涡流。在4°C孵化15分钟。
3. 洗细胞与PBS的两倍。
4. 在4°C细胞存储在PBS长达一个月。

磷酸缓冲盐(PBS) x (1)

• 0.23克不₂阿宝₄(无水,1.9毫米)
• 1.24 g Na₂HPO₄(无水,8.1毫米)
• 9.25克氯化钠(154毫米)
  
  添加H₂O 900毫升
  
  如果需要,调整所需的pH值(通常是7.2到7.4)与1 M氢氧化钠或盐酸1米。添加H₂O为1升。如果需要过滤消毒。无限期地存储在4°C
• 175.3克氯化钠
• 柠檬酸钠88.24克
  
  加入950毫升H₂O
  
  pH值调整为7和5 M盐酸
  
  稀释与H 1升₂O
  
  在室温下储存< 1个月

EDTA(乙二胺四乙酸)0.5 m, pH值8.0

186.1 g钠溶解₂乙二胺四乙酸^。2 h₂O在700毫升水搅拌。调整pH值8.0,10 M氢氧化钠,然后调整音量与H 1升₂啊,和高压蒸汽。在室温下储存< 1年。

EDTA不会溶解完全,直到pH值调整到8。

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抗体的要求:

• 免疫球蛋白亚型,Fluidigm指定100 ug /反应(不到50 ug不推荐由于贫穷的复苏)
• 无载体——没有BSA,明胶¹或其他稳定剂;叠氮化和甘油都很好
• 流式细胞术的首选认证或包含IHC;免疫印迹可能工作如果单克隆抗体识别抗原决定基的原生形式

¹我们有成功经验标记抗体明胶和BSA(争夺metal-loaded聚合物),但这些蛋白质的存在使得它无法确定恢复后多少免疫球蛋白标记每个抗体反应和金属原子的数量。可用性的标记抗体与细胞决定表达的抗原表位。

抗体标记为CyTOF

镧系元素加载的聚合物	部分减少抗体二硫键
自旋聚合物管10年代。对于每个Ab,溶解聚合物95年µL瓶之一dbPCR的L-Buffer管。	如果任何抗体量> 500 ul,开始集中在50 k自旋过滤;如果一个包含甘油集中与R-buffer洗几次。
加5µLdb混合的镧系解决聚合物溶液吸量70 x(使用障碍提示)。
孵化> 30 - 40 '的37摄氏度。
* * * lanthanide-loaded聚合物必须准备好之前,* * *的抗体
等待15分钟,从抗体→开始	确定R-Buffer需要400 ul 100 ug总db抗体。添加R-Buffer离心装置(50 k)并添加100 ug抗体,通过移液混合。 →离心12000克7”。
	摒弃滤液,等到镧系元素+聚合物孵化。
孵化后的聚合物
增加200 ul L-Buffer 3 k自旋过滤器,转移metal-loaded聚合物(100 ul)自旋过滤器。 离心机在12000 g (12)。
	准备4毫米TCEP:添加8µl 0.5 1毫升R-Buffer TCEP解决方案。
	增加100 uLdb4 mm TCEP抗体,吸管20 x →孵化在37摄氏度30”。* * *时间是至关重要的
增加300µLC缓冲,离心机12“消除自由金属。(如果部分减少抗体完成聚合物离心之前,停止与Ab)离心机和简历	添加300µLC缓冲部分减少抗体和离心机在12000克7”。 (这是为了洗掉多余的TCEP,停止削减Ab)。
在95年ul Re-suspend lanthanide-loaded聚合物德国联邦铁路(db) = 195C缓冲(残余应< 5 ul)(吸管向上和向下20 x,允许孵化过滤器在等待抗体)。	重复400µL洗C缓冲
	迅速采取行动,下一步(结合聚合物和抗体)防止re-oxidation抗体。
共轭聚合物的抗体
吸管30 x,转移lanthanide-loaded聚合物(105 uldb包含部分减少抗体)50 k滤波器。
混合轻轻移液,酝酿在37oC 60(2小时)。
添加300µL W-Buffer和离心机。400µL W-Buffer重复洗3次。@Centrifuge 7分钟,丢弃滤液
Resuspend W-buffer:剩余~ 15µl;增加88µL德国联邦铁路(db) = 188(总103 ul - 2 ul Nanodrop;999 ul ul金属含量+ 2%盐酸;100 uldb在Ab旋转下来,重建稳定剂+ 0.05%叠氮化在0.5 ug / uL)
测量抗体标记的效率
Nanodrop:测量浓度的抗体(使用2 ul)。与W-Buffer(蛋白质免疫球蛋白)(空白)
摘要:准备10倍稀释2%盐酸105。分析100 uL 105稀释。比较平均的3最高价值标准(1磅)。
抗体储存:离心机抗体10”。Resuspend抗体0.5 ug / uL存储缓冲甘油或50%。(注意~ 15 ul残余。)
聚合物的自旋过滤器:笼罩Nanosep 3 kω猫# OD030C35;离心装置:微孔Amicon超0.5毫升50 k猫# UFC505096;镧系元素的浓度是50毫米

db- ~如果接合200 ug免疫球蛋白/体积的两倍。

艾德丽安Halupa——2010年11月(修改邓肯Mak - 2017年6月)

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• 促进/抑制/治疗所需的细胞(每样1 x10 ^ 6细胞)。
• 停止信号转导,添加16%甲醛(PFA)直接管(100 ul /管、1:10)。
  • 在RT孵化为10。
  • 离心机在600 g 6 4 C。
  • 送气音。用洗清洗3 x缓冲区(pbs - 0.5% bsa - 0.02%叠氮化钠)。
  • 这个固定的步骤是有问题——PFA表面Ab的可能会影响性能。

• 注意Ab混合样品的体积,re-suspend 35-40uL 1.5 m细胞染色缓冲BSA-PBS(0.5%),添加混合Ab (10-15uL)孵化在RT 30‘-60’。
  • 洗好几次1.5毫升的洗缓冲区。涡旋混合。

在PBS(染色可行性1:50 0 Rh103 20分钟或25嗯顺铂为1分钟)

• 增加300 - 500 ul 1.6%甲醛在PBS细胞颗粒,孵化10“(或1 h) @ RT。
• 自旋向下细胞,丢弃上层清液。(没有必要洗,以减少细胞损失。)
  • 离开100 ul PBS的细胞,颗粒由涡流分手。
• Permeabilize通过添加冷100%甲醇和孵化10的4 C(喜欢-20 C 20”)(或者使用双相障碍修复/烫缓冲区或其他透化作用的方法在你的实验室工作)
  • 添加0.9毫升的甲醇/ 1 x10 ^ 6细胞(最后是90%)(50 - 90%甲醇取决于抗原表位)
  • 可选:存储在-20 C长达24小时,如果-80 C最多1个月。
• 用洗清洗用缓冲区。
  • BSA将ppt除非> 1毫升的洗缓冲区添加-需要大于相当于甲醇!
  • 离开后不到35-40uL细胞最终的清洗

• 注意每个抽样的Ab混合体积(10-15uL)
• 拨35-40uL吸管,拿起细胞在每个样品管和组成集卷染色缓冲(如从一个96孔板填满缓冲区),转移到一个新管。(染色浓度特别是做phospho-proteins)问题。
• 混合添加Ab (10-15uL),这样最后染色体积就是50 ul,酝酿在RT 30‘-60’。
  • 喜欢孵化与温和的摇摆/搅拌混合。
• 清洗和洗好几次缓冲区。
  

• 添加0.5毫升1:1000 Ir-intercalator PFA在PBS稀释1.6%至少30分钟RT(首选隔夜4 C)。
  • 扩展Ir-staining,至少一个星期,还将工作如果仪器不可用
  • (如果不是permeabilized,染色细胞与1:50 0 Ir-intercalator在0.3%皂素,洗缓冲区,20 '在rt)
• 洗2 x 2毫升的清洗缓冲(计数和过滤器最后洗如果不执行进一步的清洗)
• 为了更好的仪器稳定性:洗1 x 1毫升MilliQ水* *,(如果起始细胞计数细胞数量> 1 m, 0.5是理想的单注400 ul) * *一些细胞坚持塑料(无论它是聚苯乙烯或聚丙烯)和一个可能会失去> 90%的细胞在此步骤;用0.1% bsa MilliQ水代替。
• 过滤最后洗(通过blue-capped管(35),离开细胞颗粒残余体积(~ 50 ul)。
• Autosampler:在50 ul DIW) (resuspend细胞颗粒;添加50 ul EQ-Beads每个好,将细胞悬液(96 -深板;> 400 ul缓冲区之前将注入)。

艾德丽安Halupa,多伦多大学——2012年3月,DM修改2015年3月